引言

视神经损伤或青光眼导致的视力丧失，是因为视网膜神经节细胞 (RGCs) 无法重新生长其轴突。在成年哺乳动物中，RGCs 的内源性生长程序通常处于关闭状态，因此受损的神经无法自行愈合 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。最近的小鼠研究表明，基因疗法可以重新激活这些生长通路。例如，在成年 RGCs 中删除 PTEN 基因（细胞生长的制动器）会开启 mTOR 生长通路，并导致轴突强劲再生 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。本文回顾了如何通过操控 PTEN/mTOR、KLF 家族基因和 Sox11 来刺激 RGC 轴突再生，这些方法在小鼠身上取得了哪些成就，存在的安全问题（如癌症风险），基因递送方式（AAV 病毒载体、玻璃体腔注射或脉络膜上腔注射），以及如何从急性损伤模型过渡到慢性青光眼治疗所需的步骤。

RGCs 中的内源性生长通路

PTEN/mTOR 通路

在正常情况下，成年 RGCs 使得 mTOR 通路在很大程度上处于关闭状态，这限制了它们生长新轴突的能力 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。PTEN 是一种抑制 mTOR 的基因。科学家发现，移除成年小鼠 RGCs 中的 PTEN 可以释放 mTOR 信号，并促进轴突再生 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。在一项里程碑式研究中，成年小鼠中 PTEN 的条件性敲除导致了强大的视神经再生 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。大约 8-10% 的存活 RGCs 的轴突在损伤后 4 周内延伸超过 0.5 毫米，其中一些轴突甚至生长超过 3 毫米并到达视交叉 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。敲除另一个 mTOR 制动器 TSC1 基因也诱导了轴突再生 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

删除 PTEN 不仅刺激了再生，还提高了 RGC 的存活率（约 45% 的存活率，而对照组约为 20%） (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。然而，存在一个安全隐患：PTEN 是一种肿瘤抑制因子。长期 PTEN 缺失可能促进不受控制的细胞生长。事实上，一项主要的再生研究指出，永久性删除 PTEN 在临床上是不可接受的，因为它存在癌症风险 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。为了解决这个问题，研究人员建议使用可控的基因疗法（例如，由可切换启动子控制的 AAV 递送的 shRNA），以便在再生期间关闭 PTEN 活性，然后重新开启 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。简而言之，PTEN/mTOR 是一个强大的内部生长开关，但必须谨慎控制。

KLF 家族和 Sox11

研究人员还针对控制轴突生长的转录因子。Krüppel 样因子 (KLFs) 是此类基因的一个家族。一个关键发现是 KLF4 充当轴突生长的制动器：缺乏 KLF4 的 RGCs 比正常的生长得更好 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。在经过基因工程改造，使其 RGCs 不含 KLF4 的小鼠中，这些神经元在培养中延伸出更长的神经突，并且在视神经挤压后，有更多轴突生长出来。例如，损伤后两周，KLF4 敲除小鼠在挤压部位 1 毫米以外的再生纤维数量显著多于野生型小鼠 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。其他 KLFs 具有不同的作用：有些（如 KLF6 和 KLF7）促进生长，而另一些（如 KLF9）则抑制生长 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。因此，重新平衡 KLF 表达可以解除对 RGC 生长的一些发育性“制动” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

另一个转录因子是 Sox11，它在发育中很重要。在成年 RGCs 中过表达 Sox11（使用 AAV 基因递送）也被发现可以促进再生。在一项研究中，额外表达 Sox11 的 RGCs 在损伤后轴突再生显著增加 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。然而，Sox11 具有混合效应：它促进某些 RGC 类型再生，但可能杀死其他类型。值得注意的是，Sox11 过表达几乎杀死了所有通常对基于 PTEN 的治疗反应良好的所谓“alpha”RGCs（RGC 的一个亚型） (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。换句话说，Sox11 将一些 RGCs 重编程为具有生长能力的细胞，但它也损害了其他细胞 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。科学家们得出结论，不同的 RGC 亚型需要不同的再生策略。

关键的小鼠视神经挤压研究

视神经损伤（视神经挤压）的小鼠模型已经显示了这些基因操作在实践中如何发挥作用。一种经典方法结合了多种通路以达到最大效果。在一项 PNAS 研究中，科学家们采用了三种治疗：删除 PTEN、在眼内诱导炎症（酵母多糖）和升高 cAMP。这三者共同触发 RGCs 贯穿视神经并进入大脑视觉中枢的轴突再生 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。当他们检查经治疗小鼠的大脑时，许多再生纤维到达了外侧膝状核、上丘和其他视觉区域 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。重要的是，这种再生导致了视力相关行为的部分恢复。经治疗的小鼠重新获得了一些执行简单视觉任务的能力：它们能够追踪移动模式（视动反射），并且比受伤的对照组更能判断深度 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。（它们甚至表现出更好的昼夜节律光反应 [20†L33-L38]，尽管这些细节可能难以测量。）这项工作表明，成年小鼠的长距离轴突再生可以功能性地重新连接视觉系统的部分。

其他研究则侧重于单个因素。玻璃体腔内递送含有组成型活性 TrkB（一种脑源性神经营养因子受体）的 AAV 导致了更长的生长。例如，Nishijima 等人使用 AAV 递送工程化 TrkB（称为 F-iTrkB），观察到轴突再生超过 4.5 毫米，有些甚至到达视交叉 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。类似地，将促进生长的基因（如活性 K-Ras，一种众所周知的致癌基因）强制导入 RGCs，导致约 3 毫米的再生 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。有趣的是，在那些经治疗的眼睛中没有观察到肿瘤，但作者仍然建议使用可诱导的开/关基因开关以确保安全 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。这些及其他研究证实，开启内源性生长基因确实可以驱动小鼠视神经损伤模型中的再生。

部分视力恢复

小鼠实验通常不仅追踪解剖学变化，还追踪功能。视动反射（小鼠跟随移动条纹）和深度感知测试是观察视力是否改善的简单方法。在三重治疗研究中 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)，小鼠表现出这些反射的部分恢复。它们能够再次对移动的视觉刺激做出反应并判断深度，而未经治疗的受伤小鼠则不能 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。这是令人鼓舞的：这意味着再生的轴突建立了有用的连接。然而，恢复只是部分的。许多视觉通路（特别是精细的图像形成视觉）仍然断开。到目前为止，再生已恢复基本的视觉反应，但不是完全视力。尽管如此，看到任何功能性增益都证实了这些策略的潜力。

安全性考虑

虽然再生基因疗法前景广阔，但安全性是一个关键问题。帮助轴突生长的相同生长通路，如果任其发展，也可能导致问题。如前所述，永久性删除 PTEN 存在癌症风险 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。同样，慢性激活 mTOR 可能导致肿瘤生长（例如，TSC1/2 患者会患肿瘤）。推动生长因子（如工程化 RAS 或其他致癌基因）的基因疗法必须受到严格控制。值得注意的是，在实验性 AAV-RAS 疗法中，小鼠眼睛中没有观察到肿瘤 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)，但作者强调使用受调控（可诱导）系统，以防任何致癌活性需要关闭 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

其他安全问题包括细胞死亡和免疫反应。有些干预措施会损害某些细胞：例如，Sox11 过表达杀死了许多 alpha 型 RGCs (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。任何杀死 RGCs 的疗法都会抵消其益处。还存在注射或炎症造成的损害风险。诱导炎症（酵母多糖）有助于小鼠的再生，但在人类中将是危险的。AAV 插入的长期效应（如插入突变）很低，但任何眼部基因疗法都需要仔细评估。简而言之，每个促生长基因都必须与潜在危害相平衡：理想情况下应瞬时递送或在严格控制下进行。

基因递送策略

将基因导入正确的细胞是一个关键挑战。对于 RGCs，腺相关病毒 (AAVs) 是主力载体。AAVs 是安全、非复制型病毒，可以将治疗基因导入视网膜细胞。一种常见的方法是玻璃体腔注射：将 AAV 直接注射到眼睛的玻璃体凝胶中。AAV2 是视网膜转导的经典血清型；当玻璃体腔内注射时，它能有效到达 RGCs (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。事实上，一项研究发现玻璃体腔内注射 AAV2 转导了超过 90% 的 RGCs (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。也可以使用其他衣壳。例如，玻璃体腔内递送的 AAV6 对内视网膜和 RGC 层显示出非常高的嗜性 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。科学家们还在改造 AAV2 变体（如突变体或嵌合体）以更好地穿过视网膜屏障，但这些细节正在不断发展。

另一种途径是脉络膜上腔注射，通过针头或微导管将 AAV 递送到巩膜和脉络膜（血管层）之间。这种方法将载体广泛地扩散到视网膜下方。在猴子中，脉络膜上腔内注射 AAV8 导致了广泛的基因表达 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。这可以通过专门设计的微针完成。脉络膜上腔递送避免了大型手术，但仍然具有侵入性，并可能引起局部炎症。事实上，脉络膜上腔内注射 AAV8 引起了轻度脉络膜视网膜炎，需要类固醇治疗，尽管它在几周内消退 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。重要的是，脉络膜上腔递送引起的针对 AAV 衣壳的全身抗体反应弱于玻璃体腔递送 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。这可能是因为一些病毒以不同的方式从眼睛中逃逸。总的来说，脉络膜上腔注射有望用于眼底基因治疗，但其免疫效应需要管理。

免疫原性

尽管眼睛在某种程度上是“免疫豁免”的，但 AAV 基因递送仍可能引发免疫反应。玻璃体腔内注射的 AAV 通常通过引流通道渗出眼睛。一项在灵长类动物中的研究发现，玻璃体腔内注射 AAV 导致血液中的病毒量比视网膜下注射高约 400-500 倍 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。这导致了针对 AAV 衣壳的非常强的抗体反应 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。相比之下，视网膜下注射的 AAV（注射到视网膜下）被隔离在眼睛中，通常几乎不引起抗衣壳抗体 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。脉络膜上腔注射 AAV 介于两者之间：一些病毒留在眼睛中，而另一些到达附近的组织。研究表明，脉络膜上腔注射 AAV 引起的抗衣壳抗体产生比玻璃体腔注射更温和 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)，但它可能刺激免疫细胞对抗基因产物（如 GFP 所示），因为它转导了血视网膜屏障外的细胞 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

除了抗体，T 细胞反应也可能攻击被转导的细胞。如果插入的基因产生被身体视为外来的蛋白质（如实验中的 GFP），免疫细胞可能会清除这些细胞。即使是真正的人类基因有时也可能引发低水平炎症。临床视网膜基因试验（例如针对 RPE65）通常会给予类固醇来抑制这种反应。保留在视网膜内的途径（视网膜下、脉络膜上）总体上比玻璃体注射的免疫原性更低 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。未来的疗法需要平衡高效递送和最小免疫激活，可能需要使用更新的 AAV 类型或免疫抑制方案。

转化为青光眼治疗

青光眼提出了与急性神经挤压不同的挑战。在青光眼中，RGCs 因高眼压、血流减少和压力等因素而缓慢死亡。为了治疗青光眼，基因疗法必须在慢性损伤环境下发挥作用。这意味着时机很重要：可能需要早期给予疗法以保护 RGCs，或定期给予以重新调整生长信号。幸运的是，一些工作已经开始弥补这一差距。在最近的一项研究中，研究人员使用 AAV 将一个始终开启的 TrkB 受体（F-iTrkB）递送到青光眼模型小鼠的眼睛中。这些小鼠显示出 RGCs 的保护和显著的轴突再生 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。这表明即使在青光眼条件下，激活生长通路也能有所帮助。

然而，从挤压模型转向人类青光眼还需要更多的步骤。我们需要在动物青光眼模型（如诱导性眼压升高或遗传模型）中测试这些基因疗法，而不仅仅是在挤压模型中。我们还必须考虑衰老和病态环境：老年神经元、瘢痕组织和波动的眼压。很可能需要将基因疗法与标准青光眼护理（降低眼压、使用神经营养因子）相结合，并使用受控基因系统。例如，如前所述，AAV 构建体可以使用可诱导启动子，以便在轴突再生后关闭生长因子基因 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。由于人类青光眼进展缓慢，单次基因注射可能不够；可能需要重复给药或使用持久载体。总而言之，将这些发现转化为青光眼治疗将意味着调整以适应慢性损伤动态，并确保治疗安全和持久。

结论

调控 RGC 内源性通路的基因疗法显示出令人兴奋的潜力：在啮齿动物中，它可以使视神经再生，甚至恢复部分视力。PTEN/mTOR 激活、KLF4 缺失或Sox11 过表达等关键策略，通过不同的细胞程序分别促进再生。小鼠研究证实轴突可以重新支配大脑并改善简单的视觉任务 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。然而，必须解决安全问题（致癌风险、细胞损失、免疫反应），并完善递送方法。AAV 载体和眼内注射的进展为有效靶向 RGCs 提供了工具 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。下一步包括在慢性青光眼模型中进行测试、优化剂量和启动子，以及将基因疗法与青光眼治疗相结合。总而言之，临床前证据强烈支持进一步开发：通过仔细调整内源性生长通路，我们可能从根本上改变视神经修复的前景。