引言

青光眼是全球不可逆失明的主要原因，因为连接眼睛与大脑的视网膜神经节细胞（RGCs）会死亡且无法再生（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。如果没有RGCs，视网膜的视觉信号就无法到达大脑中心（如外侧膝状体和上丘），从而导致视力丧失。目前青光眼的治疗方法（例如降低眼压）可以保护存活的RGCs，但无法恢复已经丧失的细胞（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。干细胞疗法旨在通过将人多能干细胞（胚胎干细胞，ESCs，或诱导多能干细胞，iPSCs）分化为RGCs并将其移植到眼睛中来替代丢失的RGCs（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。原则上，这可以提供无限的视网膜神经元来源（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。但是，实现这一愿景需要克服巨大的挑战：新的RGCs必须存活，轴突必须穿过眼睛的出入口（筛板）进入视神经，长距离导航到精确的大脑目标，形成功能性突触，并髓鞘化——所有这些都发生在成年中枢神经系统的抑制环境中。

本文回顾了从人干细胞中分化RGCs并在动物模型中移植的最新进展。随后，我们讨论了成功的关键障碍——轴突穿过筛板的延伸、向丘脑和上丘目标的引导、突触形成和髓鞘化——以及安全性问题（免疫排斥、肿瘤风险）和递送方法（玻璃体腔内注射与视网膜下注射）。最后，我们对青光眼“首次人体”试验何时可行以及需要哪些结果指标给出了现实的展望。在此过程中，我们力求清晰：关键术语用粗体标示，并为非专业读者解释任何技术概念。

从人多能干细胞中分化RGCs

科学家们已经开发出许多方案，将人ESCs或iPSCs转化为RGC样神经元。通常，干细胞首先使用模拟眼睛发育的生长因子和小分子组合（例如，FGF、IGF、BMP、Wnt和Notch通路调节剂）引导至视网膜祖细胞状态（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。在适当的条件下，这些细胞会进一步分化为RGCs，这可以通过RGC标记物来证实。关键标记物包括转录因子BRN3B (POU4F2)和ISL1，RNA结合蛋白RBPMS，神经元细胞骨架蛋白β-III微管蛋白 (TUJ1)，以及synuclein-γ (SNCG)。事实上，一项研究显示，PSC衍生的培养物表达多种RGC标记物：“转录因子如BRN3、ISL1和SNCG”与长神经突一同出现，证实了RGC的身份（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。这些干细胞RGCs在基因表达和形态上与其天然对应物相似，能延伸出长的突起并产生动作电位。

RGCs并非单一的细胞类型。存在数十种RGC亚型（例如，运动敏感方向选择性细胞、on/off中心细胞、内源性光敏黑视蛋白细胞、alpha-RGCs等），每种都具有独特的功能（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。动物研究通过解剖学和分子标记物对30多种RGC亚型进行了分类（pmc.ncbi.nlm.nih.gov），证据表明人类也存在20种或更多的具有独特连接性的亚型（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。理论上，干细胞方案可以通过调整发育线索来产生特定的亚型。实践中，大多数当前方法旨在获得混合RGC群体。研究人员随后通过共染色标记物组合来验证亚型多样性：例如，一项人RGC分化研究在BRN3+细胞中识别出了候选的on-off方向选择性RGCs（表达CART）和α-RGCs（表达SPP1/骨桥蛋白）（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。优化亚型特异性是一个活跃的研究领域，因为每个RGC亚型（拥有自己的突触前和突触后伙伴）都需要在体内进行适当的整合（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。

RGC生成的效率和速度已经得到提高。早期方案需要数周或数月，但新方法加速了这一过程。例如，Luo等人通过工程化过表达转录因子NGN2并结合神经营养培养基，仅在两周内就产生了RGC样神经元，而早期的2D或3D培养则需要1-2个月（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。这些细胞表达RGC标记物，当移植到成年大鼠眼睛中时，“在一周内成功迁移到神经节细胞层”（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。类似地，以3D视网膜类器官形式培养的多能干细胞（它们重演了眼睛发育过程）自然会产生RGCs以及其他视网膜神经元。类器官衍生的RGCs的基因表达谱倾向于比2D培养的RGCs更接近胎儿RGCs，并且许多研究组现在从类器官中收集富含RGC的细胞用于移植实验（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。

尽管取得了这些进展，但产量仍然不高，培养物具有异质性。方案通常会产生混合的视网膜细胞群体，其中RGCs只占少数，并且在培养中的存活率可能有限（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。研究人员通常在移植前使用细胞分选（例如Thy1或BRN3报告基因）来纯化RGCs。一个主要目标是实现非常高的纯度，因为任何未分化或脱靶细胞都有形成肿瘤的风险。最近一项研究警告说，“对于转化研究而言，确定供体RGCs的纯度以降低畸胎瘤形成的风险至关重要”（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。

动物模型中的移植：存活与整合

目前，许多临床前研究已经在动物模型中测试了人干细胞源性RGCs。目标包括证明移植的RGCs能够存活、整合到宿主视网膜中、发出轴突，并（最终）传输信号。实验主要在啮齿动物（小鼠、大鼠）中进行，但也包括大型动物（猫）和非人灵长类动物。

在体外分化或分离RGCs后，研究人员将其递送至宿主的眼睛。主要有两种策略：玻璃体腔内注射（将细胞注射到玻璃体，即眼睛的内腔）或视网膜下递送（将细胞置于视网膜下方）。结果各异：

- 玻璃体腔内注射在技术上对于靶向RGCs（它们位于视网膜内表面）来说是直接的。多个研究组已将人RGC悬浮液或视网膜类器官衍生的RGCs注射到啮齿动物的玻璃体中。例如，Vrathasha等人将约50,000个人iPSC-RGCs玻璃体腔内注射到WS小鼠体内，发现移植细胞定位于神经节细胞层，并在移植后存活至少五个月（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。这些细胞形成了正常的树突，并产生了与小鼠自身RGCs几乎相同的光驱动动作电位（pmc.ncbi.nlm.nih.gov），证明它们至少可以在视网膜中实现功能性整合。Luo等人（2020年）也类似地表明，hESC衍生的RGC样细胞（过表达NGN2）在一周内迁移到成年大鼠的神经节层（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。这些结果令人鼓舞，但真正整合的细胞数量通常很少。Vrathasha报告每只小鼠视网膜平均有约672个存活的供体细胞（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）——这仅占正常RGC数量的一小部分——突显了环境的挑战性。

简单的玻璃体腔内悬浮液存在的一个问题是细胞常常聚集或无法黏附。在RGC损伤的猫模型中，Becker等人发现玻璃体腔内注射细胞悬浮液导致细胞聚集，几乎没有真正的整合（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。他们指出，使用支架可以改善存活率和视网膜迁移。事实上，一些研究现在将RGCs嵌入生物材料支架或类器官组织中以支持它们。例如，人视网膜类器官（在发育第60-70天收获RGCs）视网膜下移植到猫眼。在全身免疫抑制下，这些类器官移植物存活至少1个月，并似乎与宿主神经元形成了突触接触（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。视网膜下方法确保了供体组织与视网膜之间牢固的接触，而玻璃体腔内细胞悬浮液则倾向于漂浮或聚集。另一方面，视网膜下递送是更复杂的手术，可能受到可用空间的限制（四足动物和灵长类动物的视网膜下空间很薄）。

在小型啮齿动物中，玻璃体腔内递送仍然是最常用的方法。注射后，已识别出成功的供体细胞迁移到宿主视网膜神经节细胞层并表达RGC标记物（BRN3、RBPMS），持续数周至数月（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。一些研究报告供体细胞延伸出新的树突，甚至最初的轴突芽向视盘方向生长。例如，小鼠体内移植的hiPSC-RGCs显示出复杂的树突树，并且（当受到光刺激时）产生了突触后电位，表明它们与双极/无长突中间神经元形成了突触（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。然而，重要的是要谨慎：光感受器移植的经验表明，转移的荧光标记物有时可能使其看起来移植细胞已经整合，而实际上它们只是将染料传递给了宿主细胞（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。需要严谨的标记和功能测试来确认真正的整合。到目前为止，在所有案例中，只有一小部分注射的RGCs存活并整合。例如，Vrathasha等人注射了500,000个细胞，但在5个月后仅计算出约0.13%（约650个细胞）存活（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。显然，宿主视网膜环境施加了强大的选择压力，存活仍然是一个限制因素。

递送途径：玻璃体腔内注射与视网膜下递送

将RGCs递送至眼睛的选择具有实际和生物学上的影响。玻璃体腔内注射将细胞置于眼睛的凝胶（玻璃体）中，紧邻视网膜。这条途径直接浸润内视网膜，但也可能使细胞面临扩散挑战（它们必须附着在视网膜表面才能整合）。如前所述，没有支持的细胞悬浮液可能会聚集；除非细胞迅速迁移到宿主组织，否则存活率可能很低。多项研究发现，支架或类器官基础的移植物（而非单细胞悬浮液）可以改善结果（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。玻璃体腔内递送的优点是技术相对简单（已用于药物注射和基因治疗载体），并且能直接靶向RGCs。

相比之下，视网膜下递送（将细胞置于视网膜与视网膜色素上皮之间）传统上用于光感受器或RPE移植。对于RGC移植而言，这种方法不那么直观，但可以提供有利的接触。在Singh等人对猫的研究中，人视网膜类器官通过视网膜下方式植入，与宿主视网膜紧密贴合。尽管需要免疫抑制，这些移植物存活了数周，并显示出与视网膜神经节细胞形成突触的迹象（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。狭窄的视网膜下空间使供体细胞保持在原位。然而，在猫和灵长类动物中，这个空间非常薄，使得靶向具有挑战性。视网膜下手术也对宿主视网膜带来更高的风险。因此，玻璃体腔内注射在啮齿动物中仍是标准方法，而视网膜下或视网膜上（视网膜表面）策略可能会在更大的眼睛中进行探索。

总而言之，玻璃体腔内注射最简单，但通常需要支架或大量细胞才能存活（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。视网膜下移植物/细胞团可以实现牢固接触（如Singh对猫的研究所示（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）），但带来了手术挑战。这两种途径都在研究中，未来方案可能会结合细胞嵌入生物相容性支架或凝胶中，以最大限度地实现供体-宿主界面。

轴突再生和连接的障碍

即使移植的RGCs存活并在眼睛中定位，巨大的障碍仍然阻碍它们将视觉传输到大脑的能力。在正常的（成年）中枢神经系统中，受损的视神经纤维再生效果不佳。移植的RGCs面临着同样不利的环境。主要障碍包括：

轴突穿过筛板的生长

筛板是视盘处一个筛状结构，RGC轴突在此处离开眼睛。它是再生过程中的主要瓶颈。在动物实验中，研究人员发现很少有移植的RGC轴突能够穿过这个屏障。一项严谨的研究报告称，“当RGCs注射到玻璃体中时，很少有细胞整合到视网膜中。在成功整合到神经节细胞层（GCL）的RGCs中，许多细胞长出轴突并向视盘生长，但很少有轴突穿过筛板（约10%）”（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。换句话说，90%的新轴突在筛板处停滞。筛板含有致密的胶质细胞和细胞外基质，可能产生抑制信号和物理屏障。克服这一障碍可能需要对供体轴突进行工程改造（例如，通过上调mTOR或Wnt等促生长通路）或改变筛板环境（例如，应用酶或中和抑制分子）。这个问题类似于任何脊髓损伤：中枢神经系统轴突再生失败的特性。这表明即使我们将RGCs植入眼睛，要让它们的轴突进入视神经也需要非常强的促再生刺激。

向大脑目标的引导

假设RGC轴突能够离开眼睛，下一个挑战是轴突引导，即长距离到达正确的靶点（主要包括丘脑中的外侧膝状体（LGN）和中脑中的上丘）。在发育过程中，RGC轴突由分子梯度（例如，ephrin-A/EphA蛋白）和自发视网膜活动引导。成年大脑通常缺乏这些线索。一些啮齿动物研究表明，有可能引导再生的RGC轴突与上丘重新连接：例如，一个视神经束损伤模型上调了促生长基因（mTOR, JAK/STAT），并在上丘观察到新的突触（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。然而，这些再生的轴突除非得到人工支持（参见下面的髓鞘化），否则无法恢复视力。简而言之，找到正确的引导信号（或提供它们）是一个开放的研究问题。移植的RGC轴突理想情况下应该重现胚胎期的引导线索，以在大脑中形成正确的视网膜拓扑图，但目前尚不清楚如何在成年动物中实现这一点。

突触形成

新的轴突最终必须与正确的靶神经元形成突触。令人鼓舞的是，有证据表明移植的RGCs至少可以在视网膜内形成突触连接。在Johnson等人的研究中，迁移到宿主GCL的hiPSC衍生的RGCs形成了正常的树突树。通过突触标记物染色和光刺激，作者“证明了供体RGCs与宿主视网膜之间形成了新颖且功能性的突触”（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。换句话说，移植的RGCs能够与双极细胞/无长突细胞中间神经元连接，并将信号传输到下游宿主细胞，尽管其反应比天然细胞稍弱。这一发现表明，至少在内视网膜层面，可以发生适当的布线。

在大脑中实现和测量突触形成更加困难。一些再生研究（并非严格意义上的移植研究）已诱导RGC轴突向丘脑再生并形成突触（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。在上述视神经束损伤模型中，视交叉上/丘脑区域的新轴突确实形成了突触，但小鼠仍没有可测量的视觉行为。这后来被归因于缺乏髓鞘（见下一节），而非突触缺陷（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。底线是：突触形成原则上是可能的，但确保强大、精确靶向的突触以恢复视力是一个主要障碍。这可能需要“类似发育”的线索，例如模式光刺激（视网膜波）或辅助胶质细胞的共移植，以引导和加强新的连接。

再生轴突的髓鞘化

最后，RGC轴突通常只有在穿过筛板后才会髓鞘化——这是眼睛一个有趣的设计特征。少突胶质细胞（中枢神经系统髓鞘形成细胞）被筛板阻挡在视网膜之外（pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）。如果移植RGC的轴突离开眼睛，它会进入含有髓鞘形成胶质细胞的中枢神经系统。然而，在许多实验案例中，新轴突仍然未髓鞘化。这很重要，因为未髓鞘化的长中枢神经系统轴突传导冲动非常差。在上述视神经束再生研究中，作者发现新形成的轴突未髓鞘化，并且小鼠没有表现出视觉改善，除非给予4-氨基吡啶（4-AP）——一种阻断钾通道并增强去髓鞘纤维传导的药物（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。实际上，4-AP通过补偿髓鞘缺乏部分恢复了视力。这个结果强调了这一点：即使RGC轴突到达其靶点，如果没有髓鞘，它也不会以足够快的速度传导信号以实现视力。确保适当的髓鞘化——可能通过共移植少突胶质细胞前体或刺激宿主胶质细胞——将至关重要。

综上所述，移植的RGCs面临着严峻的挑战：只有少数能够穿过筛板生长（pmc.ncbi.nlm.nih.gov），它们必须找到通往大脑靶点的正确路径，形成适当的突触，然后被髓鞘包裹。目前，动物模型中的每一步都只取得了部分成功。克服这些障碍是神经再生研究的活跃领域。

免疫和安全挑战

眼睛相对来说是免疫豁免器官，但细胞移植仍然存在免疫攻击的风险。如果供体细胞是自体细胞（来自患者自身的iPSCs），排斥反应最小但技术复杂性高。异体细胞（来自另一供体或干细胞系）更容易生产，但可能受到宿主免疫系统的攻击。在动物研究中，研究人员通常使用免疫抑制药物来促进移植物存活。例如，在猫类器官移植研究中，需要全身免疫抑制才能使移植物存活并形成连接（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。如果没有免疫抑制，异种细胞会迅速被清除。有趣的是，大多数视网膜移植的临床前研究报告的只是低度炎症而非完全排斥——这是眼睛屏障的一个好处（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。然而，长期成功可能需要短暂的免疫抑制或先进技术（例如用免疫逃逸涂层“隐蔽”细胞）（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。未来任何人体试验都需要解决这个问题，以确保供体RGCs不被宿主T细胞杀死。

一个相关的问题是致瘤性。如果未分化的细胞被移植，多能干细胞可能会形成畸胎瘤。RGC制剂中即使少量污染的PSC也可能造成灾难性后果。因此，研究人员强调移植物群体的高纯度。Vrathasha等人指出，“确定供体RGCs的纯度以降低畸胎瘤形成的风险至关重要”（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。这需要彻底的质量控制——例如，通过RGC特异性报告基因或使用流式细胞术进行细胞分选，并通过基因组甲基化或基因表达分析进行测试，以确保没有多能细胞残留（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。到目前为止，在小型动物RGC移植实验中尚未报告肿瘤，但临床转化将要求任何干细胞产品都进行极其严格的纯化和放行测试。

展望：青光眼人体试验之路

鉴于上述严峻挑战，人们何时能合理预期青光眼患者RGC替代疗法的首次临床试验？不幸的是，答案很可能是“不会很快”。该领域仍处于临床前早期阶段（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。迄今为止，尚未有专门针对青光眼RGC移植的人体试验注册。现有的“干细胞诊所”（例如，误导性的自体脂肪或骨髓细胞试验）专注于临时方法，并已明显造成伤害（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。患者应对规避FDA监管的未经证实疗法保持警惕。合法的人体首次试验需要有坚实的动物概念验证来解决每个障碍，并提供可靠的安全性数据。这可能需要许多年。

一个务实的展望是，如果进展持续，小型安全性试验可能会在2020年代末或2030年代开始。受试者可能包括晚期疾病患者（视网膜和视神经可能已大部分断开），或者反之，中期疾病患者（以最大限度地提高任何获益的机会）。初步主要终点将是安全性：眼睛无不良炎症反应或肿瘤形成。次要终点旨在检测移植物“植入”的任何解剖学或功能性迹象。例如，视网膜成像（光学相干断层扫描）可以观察细胞注射处视网膜神经纤维层或神经节细胞层的增厚。电生理学测试，如模式视网膜电图（PERG）或视觉诱发电位（VEP），可能会揭示源自移植细胞的电反应。最终，功能性视力测试（如视野或对比敏感度）将很重要，但即使能证明恢复一小段弧形视力也将是开创性的。类比而言，最近针对遗传性视网膜疾病的基因治疗试验测量结构性与功能性类别的结果（pmc.ncbi.nlm.nih.gov）；类似的类别（OCT解剖学、电生理学、视觉功能、患者报告的视力）也将适用。

总而言之，尽管存在谨慎的乐观情绪，但任何实际的时间表都很漫长。上述每个步骤都需要完善。一个现实的首次试验可能在2030年代中后期设计，这取决于轴突再生和安全性的突破。候选者和终点将仔细选择：可能首先是安全性终点，然后是整合的替代指标（成像、电生理学），然后再期望可测量的视力改善。换句话说，该领域必须在希望与现实之间取得平衡——追求RGC替代将是一场研究的马拉松，而非短跑。

结论

用实验室培养的RGC替代青光眼中丢失的RGC是一个令人兴奋但刚刚起步的想法。在体外，人多能干细胞可以被诱导分化成表达关键标记物甚至某些亚型特征的RGC样细胞（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。动物移植研究表明，这些细胞中的一小部分可以存活数月，整合到视网膜回路中，并可能形成突触（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pmc.ncbi.nlm.nih.gov）。然而，巨大的障碍依然存在。轴突穿过筛板的生长不良（pmc.ncbi.nlm.nih.gov），向中央目标的引导控制不足，突触微弱或缺失，轴突缺乏髓鞘（pmc.ncbi.nlm.nih.gov） （pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）。除此之外，还必须管理免疫排斥和肿瘤风险。目前，研究人员正继续逐一攻克这些挑战。在我们能够可靠地培养、递送和连接干细胞RGCs之前，恢复视力的移植仍将停留在实验室阶段。但稳步的进展带来了一定的希望：随着持续的创新和谨慎，将RGC从“培养皿到视神经径”替代的梦想，有朝一日可能从实验走向治愈。