Ievads

Redzes zudums, ko izraisa redzes nerva bojājumi vai glaukoma, rodas tāpēc, ka tīklenes ganglija šūnas (RGC) nespēj atjaunot savus aksonus. Pieaugušiem zīdītājiem RGC iekšējās augšanas programma parasti ir izslēgta, tāpēc bojāti nervi paši neatjaunojas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jaunākie pētījumi ar pelēm liecina, ka gēnu terapija var reaktivēt šos augšanas ceļus. Piemēram, PTEN gēna (šūnu augšanas bremze) dzēšana pieaugušu RGC šūnās ieslēdz mTOR augšanas ceļu un izraisa spēcīgu aksonu atjaunošanos (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šajā rakstā mēs aplūkojam, kā PTEN/mTOR, KLF ģimenes gēnu un Sox11 manipulēšana var stimulēt RGC aksonu reģenerāciju, ko tas ir sasniedzis pelēm, drošības jautājumus (piemēram, vēža risku), kā gēni tiek piegādāti (AAV vīrusu vektori, intravitreāla vai suprahoidāla injekcija) un kādi soļi ir nepieciešami, lai pārietu no akūtu traumu modeļiem uz hroniskas glaukomas ārstēšanu.

RGC iekšējie augšanas ceļi

PTEN/mTOR ceļš

Normālos apstākļos pieaugušās RGC šūnas lielā mērā tur mTOR ceļu izslēgtu, kas ierobežo to spēju veidot jaunus aksonus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN ir gēns, kas inhibē mTOR. Zinātnieki atklāja, ka PTEN noņemšana pieaugušu peļu RGC šūnās atbrīvo mTOR signalizāciju un ļauj atjaunoties aksoniem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vienā no nozīmīgākajiem pētījumiem, kondicionēta PTEN gēna izslēgšana pieaugušām pelēm izraisīja spēcīgu redzes nerva reģenerāciju (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Aptuveni 8–10% no izdzīvojušajām RGC šūnām pagarināja aksonus vairāk nekā 0,5 mm aiz bojājuma vietas, dažiem aksoniem augot vairāk nekā 3 mm un pat sasniedzot redzes krustojumu 4 nedēļas pēc traumas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vēl vienas mTOR bremzes, TSC1 gēna, izslēgšana arī inducēja aksonu atjaunošanos (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

PTEN dzēšana ne tikai veicināja atjaunošanos, bet arī uzlaboja RGC izdzīvošanu (aptuveni 45% izdzīvošanas salīdzinājumā ar ~20% kontroles grupā) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tomēr pastāv drošības problēma: PTEN ir audzēju supresors. Ilgstošs PTEN zudums var veicināt nekontrolētu šūnu augšanu. Patiešām, nozīmīgā reģenerācijas pētījumā tika atzīmēts, ka pastāvīga PTEN dzēšana būtu klīniski nepieņemama vēža riska dēļ (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lai to risinātu, pētnieki iesaka izmantot kontrolējamu gēnu terapiju (piemēram, AAV piegādātu shRNS zem pārslēdzama promotora), lai PTEN aktivitāti varētu izslēgt atjaunošanās laikā un pēc tam atkal ieslēgt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Īsumā, PTEN/mTOR ir spēcīgs iekšējais augšanas slēdzis, taču tas ir rūpīgi jākontrolē.

KLF ģimene un Sox11

Pētnieki ir vērsušies arī pret transkripcijas faktoriem, kas kontrolē aksonu augšanu. Krīpeļa līdzīgie faktori (KLF) ir šādu gēnu saime. Galvenais atklājums ir tas, ka KLF4 darbojas kā bremze aksonu augšanai: RGC šūnas, kurām trūkst KLF4, aug labāk nekā parasti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pelēm, kurām RGC šūnās nebija KLF4, šie neironi kultūrā veidoja daudz garākus neirītus, un pēc redzes nerva saspiešanas izauga daudz vairāk aksonu. Piemēram, divas nedēļas pēc traumas KLF4-izslēgšanas pelēm bija ievērojami vairāk reģenerējošu šķiedru vairāk nekā 1 mm attālumā no saspiešanas vietas nekā savvaļas tipa pelēm (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Citiem KLF ir dažādas lomas: daži (piemēram, KLF6 un KLF7) veicina augšanu, bet citi (piemēram, KLF9) to nomāc (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tādējādi KLF ekspresijas līdzsvarošana var atcelt dažas attīstības “bremzes” RGC augšanā (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Cits transkripcijas faktors ir Sox11, kas ir svarīgs attīstībā. Tika konstatēts, ka Sox11 pārmērīga ekspresija pieaugušu RGC šūnās (izmantojot AAV gēnu piegādi) arī veicina reģenerāciju. Vienā pētījumā RGC šūnās ar papildu Sox11 tika novērots ievērojams aksonu atjaunošanās pieaugums pēc traumas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tomēr Sox11 ir jaukta iedarbība: tas veicina atjaunošanos noteiktos RGC tipos, bet var nogalināt citus. Īpaši jāatzīmē, ka Sox11 pārmērīga ekspresija iznīcināja gandrīz visas tā sauktās “alfa” RGC šūnas (RGC apakštips), kas parasti labi reaģē uz PTEN bāzes ārstēšanu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Citiem vārdiem sakot, Sox11 pārprogrammē dažas RGC šūnas augšanai spējīgā stāvoklī, taču tas arī kaitē citām (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Zinātnieki secina, ka dažādiem RGC apakštipiem ir nepieciešamas dažādas atjaunošanās stratēģijas.

Galvenie peļu redzes nerva saspiešanas pētījumi

Peļu redzes nerva bojājumu modeļi (redzes nerva saspiešana) ir parādījuši, kā šīs gēnu manipulācijas darbojas praksē. Klasiska pieeja apvienoja ceļus maksimālai iedarbībai. Vienā PNAS pētījumā zinātnieki pielietoja trīs ārstēšanas metodes: PTEN dzēšanu, iekaisuma inducēšanu acī (zimozāns) un cAMF paaugstināšanu. Šis trio ierosināja RGC šūnas atjaunot aksonus visā redzes nerva garumā un smadzeņu redzes centros (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pārbaudot ārstēto peļu smadzenes, daudzas reģenerējošās šķiedras sasniedza sānu ceļgala kodolu, augšējo kolikulu un citas redzes zonas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Svarīgi ir tas, ka šī atjaunošanās izraisīja daļēju redzes saistīto uzvedības modeļu atjaunošanos. Ārstētās peles atguva spēju veikt vienkāršus vizuālos uzdevumus: tās spēja izsekot kustīgiem attēliem (optomotors reflekss) un labāk novērtēt dziļumu nekā ievainotās kontroles grupas peles (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Tās pat uzrādīja labākas diennakts gaismas reakcijas [20†L33-L38], lai gan šīs detaļas var būt grūti izmērāmas.) Šis darbs parādīja, ka tālas distances aksonu reģenerācija pieaugušām pelēm var funkcionāli savienot atpakaļ redzes sistēmas daļas.

Citi pētījumi koncentrējās uz individuāliem faktoriem. Intravitreāli piegādājot AAV, kas satur konstitutīvi aktīvu TrkB (no smadzenēm iegūta neirotrofiskā faktora receptors), tika panākta vēl ilgāka augšana. Piemēram, Nišidžima un citi izmantoja inženierētu TrkB (saukts par F-iTrkB), kas tika piegādāts ar AAV, un novēroja, ka aksoni atjaunojās vairāk nekā 4,5 mm garumā, daži pat sasniedzot redzes krustojumu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Līdzīgi, augšanu veicinoša gēna, piemēram, aktīva K-Ras (pazīstams onkogēns), ievadīšana RGC šūnās radīja aptuveni 3 mm reģenerāciju (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Interesanti, ka šajās ārstētajās acīs netika novēroti audzēji, taču autori joprojām iesaka drošības nolūkos izmantot inducējamus ieslēgšanas/izslēgšanas gēnu slēdžus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šie un citi pētījumi apstiprina, ka iekšējo augšanas gēnu ieslēgšana patiešām var veicināt reģenerāciju peļu redzes nerva bojājumu modeļos.

Daļēja redzes atjaunošanās

Peļu eksperimenti bieži vien izsekoja ne tikai anatomiju, bet arī funkciju. Optomotors reflekss (peles seko kustīgām svītrām) un dziļuma uztveres testi ir vienkārši veidi, kā noteikt, vai redze uzlabojas. Trīskāršās ārstēšanas pētījumā (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) peles uzrādīja daļēju šo refleksu atjaunošanos. Tās atkal varēja reaģēt uz kustīgiem attēliem un novērtēt dziļumu, savukārt ievainotās peles bez ārstēšanas to nespēja (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tas ir iedrošinoši: tas nozīmē, ka atjaunotie aksoni izveidoja noderīgus savienojumus. Tomēr atjaunošanās bija tikai daļēja. Daudzi redzes ceļi (īpaši smalkā attēlu veidošanas redze) paliek atvienoti. Līdz šim reģenerācija ir atjaunojusi pamata redzes reakcijas, bet ne pilnīgu redzi. Tomēr jebkāda funkcionāla uzlabojuma novērošana apstiprina šo stratēģiju potenciālu.

Drošības apsvērumi

Lai gan gēnu terapija reģenerācijai ir daudzsološa, drošība ir kritiska problēma. Tie paši augšanas ceļi, kas palīdz aksoniem, var radīt problēmas, ja tie netiek kontrolēti. Kā minēts, pastāvīga PTEN dzēšana rada vēža risku (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tāpat hroniska mTOR aktivēšana var izraisīt audzēju augšanu (piemēram, TSC1/2 pacientiem veidojas audzēji). Gēnu terapijas, kas veicina augšanas faktorus (piemēram, inženierēts RAS vai citi onkogēni), ir rūpīgi jākontrolē. Īpaši jāatzīmē, ka eksperimentālajā AAV-RAS terapijā audzēji netika novēroti peļu acīs (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), taču autori uzsver regulētu (inducējamu) sistēmu izmantošanu, ja nepieciešams izslēgt jebkādu onkogēnu aktivitāti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Citas drošības problēmas ietver šūnu nāvi un imūnreakcijas. Dažas iejaukšanās kaitē noteiktām šūnām: piemēram, Sox11 pārmērīga ekspresija iznīcināja daudzas alfa tipa RGC šūnas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jebkura terapija, kas nogalina RGC šūnas, atsver tās ieguvumu. Pastāv arī bojājumu risks no injekcijām vai iekaisuma. Iekaisuma (zimozāna) inducēšana palīdzēja reģenerācijai pelēm, bet cilvēkiem tas būtu bīstami. AAV ieliktņu ilgtermiņa ietekme (piemēram, insercijas mutaģenēze) ir zema, taču jebkura acs gēnu terapija prasa rūpīgu novērtēšanu. Īsumā, katrs augšanu veicinošais gēns ir jālīdzsvaro ar potenciālo kaitējumu: ideāli to piegādājot pārejoši vai stingrā kontrolē.

Gēnu piegādes stratēģijas

Gēnu ievadīšana pareizajās šūnās ir galvenais izaicinājums. RGC šūnām adenovīrusu asociētie vīrusi (AAV) ir galvenie vektori. AAV ir droši, nereplicējoši vīrusi, kas var pārnest terapeitiskos gēnus tīklenes šūnās. Bieži izmantota metode ir intravitreāla injekcija: AAV ievadīšana tieši acs stiklveida ķermenī. AAV2 ir klasiskais serotips tīklenes transdukcijai; tas efektīvi sasniedz RGC šūnas, ievadot intravitreāli (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Patiešām, viens pētījums atklāja, ka intravitreālais AAV2 transdukēja vairāk nekā 90% RGC šūnu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Var izmantot arī citus kapsīdus. Piemēram, AAV6, ievadīts intravitreāli, uzrāda ļoti augstu tropismu pret iekšējo tīkleni un RGC slāni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Zinātnieki arī inženierē AAV2 variantus (piemēram, mutācijas vai himēras), lai vēl labāk šķērsotu tīklenes barjeras, taču šīs detaļas attīstās.

Cits ceļš ir suprahoidāla injekcija, kurā adata vai mikrokanula piegādā AAV starp sklēru un horoideu (asinsvadu slāni). Šī pieeja plaši izplata vektoru zem tīklenes. Suprahoidālais AAV8 pērtiķiem izraisīja plašu gēnu ekspresiju (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). To var veikt ar speciāli izstrādātām mikroadatām. Suprahoidāla piegāde ļauj izvairīties no lielas operācijas, taču tā joprojām ir invazīva un var izraisīt lokālu iekaisumu. Patiešām, suprahoidālais AAV8 izraisīja vieglu horeoretinītu (horoīda iekaisumu), kas prasīja steroīdu lietošanu, lai gan tas atrisinājās dažu nedēļu laikā (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Svarīgi ir tas, ka suprahoidāla piegāde izraisīja vājākas sistēmiskās antivielu reakcijas pret AAV kapsīdu nekā intravitreāla piegāde (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tas, visticamāk, ir tāpēc, ka daļa vīrusa atšķirīgi izkļūst no acs. Kopumā suprahoidāla injekcija ir daudzsološa gēnu terapijai acs aizmugurē, taču tās imūnās ietekmes ir jāvada.

Imunogenitāte

Lai gan acs ir zināmā mērā “imūni privileģēta”, AAV gēnu piegāde joprojām var izraisīt imūnreakcijas. Intravitreālais AAV bieži izplūst no acs caur drenāžas kanāliem. Viens pētījums ar primātiem atklāja, ka intravitreālais AAV izraisīja ~400–500 reizes vairāk vīrusa asinsritē, salīdzinot ar subretinālu injekciju (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tas izraisīja ļoti spēcīgu antivielu reakciju pret AAV kapsīdu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Savukārt subretinālais AAV (injicēts zem tīklenes) tiek sekvestrēts acī un parasti izraisa gandrīz nekādas anti-kapsīda antivielas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprahoidālais AAV atrodas pa vidu: daļa vīrusa paliek acī, bet daļa sasniedz tuvējos audus. Pētījumi liecina, ka suprahoidālais AAV izraisa maigāku anti-kapsīda antivielu ražošanu nekā intravitreālais (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), taču tas var stimulēt imūnšūnas pret gēna produktu (kā redzams ar GFP), jo tas transdukē šūnas ārpus asins-tīklenes barjeras (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Papildus antivielām T-šūnu reakcijas var uzbrukt transdukētām šūnām. Ja ievietotais gēns ražo proteīnu, ko organisms uzskata par svešu (piemēram, GFP eksperimentos), imūnšūnas var attīrīt šīs šūnas. Pat īsti cilvēka gēni dažkārt var izraisīt zema līmeņa iekaisumu. Klīniskajos tīklenes gēnu pētījumos (piemēram, RPE65 gadījumā) bieži tiek doti steroīdi, lai mazinātu šo reakciju. Ceļi, kas paliek tīklenē (subretināli, suprahoidāli), kopumā mēdz būt mazāk imunogēni nekā stiklveida ķermeņa injekcijas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nākotnes terapijām būs jālīdzsvaro efektīva piegāde ar minimālu imūnaktivāciju, iespējams, izmantojot jaunākus AAV tipus vai imūnsupresīvus režīmus.

Pielietojums glaukomas ārstēšanā

Glaukoma rada atšķirīgu izaicinājumu nekā akūts nervu saspiešanas bojājums. Glaukomā RGC šūnas lēnām iet bojā tādu faktoru dēļ kā augsts acs spiediens, samazināta asins plūsma un stress. Lai ārstētu glaukomu, gēnu terapijai jādarbojas hroniska bojājuma apstākļos. Tas nozīmē, ka laiks ir svarīgs: terapijas var būt jāveic agri, lai aizsargātu RGC šūnas, vai periodiski, lai atkārtoti noregulētu augšanas signālus. Par laimi, daži darbi sāk pārvarēt šo plaisu. Nesenā pētījumā pētnieki izmantoja AAV, lai piegādātu vienmēr aktīvu TrkB receptoru (F-iTrkB) glaukomas modeļa peļu acīs. Šīm pelēm tika novērota gan RGC šūnu aizsardzība, gan ievērojama aksonu reģenerācija (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tas liecina, ka pat glaukomas apstākļos augšanas ceļu aktivizēšana var palīdzēt.

Tomēr pāreja no saspiešanas modeļiem uz cilvēka glaukomu prasīs vairāk soļu. Mums ir jāpārbauda šīs gēnu terapijas dzīvnieku glaukomas modeļos (piemēram, inducētas acs hipertensijas vai ģenētiskajos modeļos), nevis tikai saspiešanas modeļos. Mums ir jāņem vērā arī novecošanās un slimā vide: vecāki neironi, rētaudi un mainīgs acs spiediens. Visticamāk, būs nepieciešams apvienot gēnu terapiju ar standarta glaukomas aprūpi (spiediena pazemināšana, neirotrofisko faktoru izmantošana) un izmantot kontrolētas gēnu sistēmas. Piemēram, kā minēts, AAV konstruktos varētu izmantot inducējamus promotorus, lai augšanas faktora gēnu varētu izslēgt pēc aksonu atjaunošanās (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tā kā cilvēka glaukoma progresē lēni, viena gēna injekcija var nebūt pietiekama; var būt nepieciešama atkārtota dozēšana vai ilgstoši vektori. Rezumējot, šo atklājumu pielietošana glaukomas terapijā nozīmēs pielāgošanos hroniska bojājuma dinamikai un nodrošināšanu, ka ārstēšana ir droša un ilgstoša.

Secinājums

Gēnu terapija, kas modulē RGC iekšējos ceļus, demonstrē aizraujošu potenciālu: grauzējiem tā var panākt redzes nerva atjaunošanos un pat atjaunot daļu redzes. Galvenās stratēģijas, piemēram, PTEN/mTOR aktivēšana, KLF4 dzēšana vai Sox11 pārmērīga ekspresija, katra nodrošina reģeneratīvu stimulu, izmantojot dažādas šūnu programmas. Pētījumi ar pelēm apstiprina, ka aksoni var reinervēt smadzenes un uzlabot vienkāršus vizuālos uzdevumus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tomēr ir jārisina drošības jautājumi (onkogēnais risks, šūnu zudums, imūnreakcija) un jāpilnveido piegādes metodes. AAV vektoru un acs injekciju attīstība nodrošina rīkus RGC šūnu efektīvai mērķēšanai (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nākamie soļi ietver testēšanu hroniskas glaukomas modeļos, dozēšanas un promotoru optimizēšanu, kā arī gēnu terapijas kombinēšanu ar glaukomas ārstēšanu. Kopumā preklīniskie pierādījumi stingri atbalsta turpmāku attīstību: rūpīgi pielāgojot iekšējos augšanas ceļus, mēs varam būtiski mainīt redzes nerva atjaunošanas perspektīvas.