Įvadas

Regėjimo praradimas dėl regos nervo pažeidimo ar glaukomos atsiranda todėl, kad tinklainės ganglijų ląstelės (TGL) nesugeba atauginti savo aksonų. Suaugusiems žinduoliams, TGL vidinis augimo procesas paprastai yra sustabdytas, todėl pažeisti nervai patys neužgyja (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Naujausi pelių tyrimai rodo, kad genų terapija gali reaktyvuoti šiuos augimo kelius. Pavyzdžiui, ištrynus PTEN geną (ląstelių augimo stabdį) suaugusių TGL ląstelėse, suaktyvinamas mTOR augimo kelias ir sukeliamas stiprus aksonų ataugimas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šiame straipsnyje apžvelgiame, kaip manipuliuojant PTEN/mTOR, KLF šeimos genais ir Sox11 galima stimuliuoti TGL aksonų regeneraciją, kokie rezultatai pasiekti su pelėmis, kokios yra saugumo problemos (pvz., vėžio rizika), kaip genai pristatomi (AAV virusiniai vektoriai, intrakamerinė ar suprachoroidinė injekcija) ir kokius žingsnius reikia žengti pereinant nuo ūmių pažeidimų modelių prie lėtinės glaukomos gydymo.

TGL vidiniai augimo keliai

PTEN/mTOR kelias

Normaliomis sąlygomis, suaugusių TGL ląstelėse mTOR kelias didžiąja dalimi yra išjungtas, kas apriboja jų gebėjimą auginti naujus aksonus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN yra genas, slopinantis mTOR. Mokslininkai nustatė, kad pašalinus PTEN iš suaugusių pelių TGL, išlaisvinamas mTOR signalizavimas ir leidžiama aksonams ataugti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Viename reikšmingame tyrime, sąlyginis PTEN geno išjungimas suaugusioms pelėms lėmė stiprią regos nervo regeneraciją (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Apie 8–10% išgyvenusių TGL aksonų išsiplėtė daugiau nei 0,5 mm nuo pažeidimo vietos, kai kurie aksonai išaugo daugiau nei 3 mm ir net pasiekė regos nervų kryžmę per 4 savaites po pažeidimo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Išjungus dar vieną mTOR stabdį, TSC1 geną, taip pat buvo paskatintas aksonų ataugimas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

PTEN pašalinimas ne tik paskatino ataugimą, bet ir pagerino TGL išgyvenimą (apie 45% išgyvenamumas, palyginti su ~20% kontrolinėse grupėse) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tačiau kyla saugumo problemų: PTEN yra naviko slopintojas. Ilgalaikis PTEN praradimas gali skatinti nekontroliuojamą ląstelių augimą. Iš tiesų, dideliame regeneracijos tyrime buvo pažymėta, kad nuolatinis PTEN pašalinimas būtų kliniškai nepriimtinas dėl vėžio rizikos (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Siekdami išspręsti šią problemą, tyrėjai siūlo naudoti kontroliuojamą genų terapiją (pvz., AAV pristatytą shRNA, veikiantį pagal perjungiamąjį promotorių), kad PTEN aktyvumas galėtų būti išjungiamas ataugimo metu ir vėl įjungiamas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Trumpai tariant, PTEN/mTOR yra galingas vidinis augimo jungiklis, tačiau jį reikia kruopščiai kontroliuoti.

KLF šeima ir Sox11

Tyrėjai taip pat taikėsi į transkripcijos faktorius, kurie kontroliuoja aksonų augimą. Krüppel panašūs faktoriai (KLF) yra tokios genų šeima. Svarbus atradimas yra tai, kad KLF4 veikia kaip aksonų augimo stabdys: TGL, kurioms trūksta KLF4, auga geriau nei įprastai (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pelėms, kurių TGL neturi KLF4, šie neuronai išaugino daug ilgesnius neuritus kultūroje, o po regos nervo sutraiškymo išaugo daug daugiau aksonų. Pavyzdžiui, dvi savaitės po pažeidimo, KLF4-išjungtos pelės turėjo žymiai daugiau regeneruojančių skaidulų toliau nei 1 mm nuo sutraiškymo vietos, nei laukinio tipo pelės (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kiti KLF genai atlieka įvairius vaidmenis: kai kurie (pvz., KLF6 ir KLF7) skatina augimą, o kiti (pvz., KLF9) jį slopina (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Taigi, KLF ekspresijos pusiausvyros atkūrimas gali pašalinti kai kuriuos vystymosi „stabdžius“ TGL augimui (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Kitas transkripcijos faktorius yra Sox11, svarbus vystymuisi. Nustatyta, kad Sox11 pertekliaus ekspresija suaugusių TGL (naudojant AAV genų pristatymą) taip pat skatina regeneraciją. Viename tyrime TGL su papildomu Sox11 parodė ryškų aksonų ataugimo padidėjimą po pažeidimo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tačiau Sox11 turi mišrų poveikį: jis skatina ataugimą tam tikruose TGL tipuose, bet gali nužudyti kitus. Pažymėtina, kad Sox11 pertekliaus ekspresija sunaikino beveik visas vadinamąsias „alfa“ TGL (TGL potipį), kurios paprastai gerai reaguoja į PTEN pagrindu veikiančius gydymus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kitaip tariant, Sox11 perprogramuoja kai kurias TGL į augimui tinkamą būseną, bet taip pat kenkia kitoms (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Mokslininkai daro išvadą, kad skirtingiems TGL potipiams reikalingos skirtingos ataugimo strategijos.

Pagrindiniai pelių regos nervo sutraiškymo tyrimai

Pelių regos nervo pažeidimo (regos nervo sutraiškymo) modeliai parodė, kaip šios genų manipuliacijos veikia praktiškai. Klasikinis metodas sujungė kelius maksimaliam efektui pasiekti. Viename PNAS tyrime mokslininkai pritaikė tris gydymo būdus: PTEN pašalinimą, uždegimo sukėlimą akyje (zimozanas) ir cAMP padidinimą. Šis trejetas paskatino TGL atauginti aksonus visu regos nervu ir į smegenų regos centrus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ištyrus gydytų pelių smegenis, daugelis regeneruojančių skaidulų pasiekė šoninį kelinį branduolį, viršutinį kalnelį ir kitas regos sritis (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Svarbu, kad šis ataugimas lėmė dalinį su regėjimu susijusių elgsenų atkūrimą. Gydytos pelės atgavo gebėjimą atlikti paprastas regos užduotis: jos galėjo sekti judančius raštus (optomotorinis refleksas) ir geriau vertinti gylį nei sužalotos kontrolinės grupės pelės (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Jie net parodė geresnius cirkadinius šviesos atsakas [20†L33-L38], nors šias detales gali būti sunku išmatuoti.) Šis darbas parodė, kad tolimųjų aksonų regeneracija suaugusioms pelėms gali funkciškai iš naujo sujungti regos sistemos dalis.

Kiti tyrimai sutelkė dėmesį į individualius veiksnius. Intrakameriškai pristatant AAV, nešantį nuolat aktyvų TrkB (iš smegenų gauto neurotrofinio faktoriaus receptorių), sukėlė dar ilgesnį augimą. Pavyzdžiui, Nishijima ir kt. naudojo inžinerinį TrkB (vadinamą F-iTrkB), pristatytą AAV pagalba, ir stebėjo, kad aksonai ataugo daugiau nei 4,5 mm, o kai kurie pasiekė regos nervų kryžmę (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Panašiai, įterpus augimą skatinantį geną, pvz., aktyvų K-Ras (gerai žinomą onkogeną) į TGL, buvo pasiekta apie 3 mm regeneracija (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Įdomu tai, kad gydytose akyse nebuvo pastebėta navikų, tačiau autoriai vis tiek rekomenduoja naudoti indukcinius įjungimo/išjungimo genų jungiklius saugumo sumetimais (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šie ir kiti tyrimai patvirtina, kad įjungus vidinius augimo genus, iš tiesų galima skatinti regeneraciją pelių regos nervo pažeidimo modeliuose.

Dalinis regėjimo atkūrimas

Pelių eksperimentuose dažnai buvo stebima ne tik anatomija, bet ir funkcija. Optomotorinis refleksas (pelės, sekančios judančias juostas) ir gylio suvokimo testai yra paprasti būdai patikrinti, ar regėjimas gerėja. Trigubo gydymo tyrime (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) pelės parodė dalinį šių refleksų atkūrimą. Jos vėl galėjo reaguoti į judančius vaizdus ir vertinti gylį, o sužalotos pelės be gydymo to negalėjo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tai džiugina: tai reiškia, kad ataugę aksonai sudarė naudingus ryšius. Tačiau atsistatymas buvo tik dalinis. Daugelis regos takų (ypač smulkaus vaizdo formavimo regėjimas) lieka atjungti. Kol kas regeneracija atkūrė pagrindinius regos atsakas, bet ne visą regėjimą. Vis dėlto, bet koks funkcinis pagerėjimas patvirtina šių strategijų potencialą.

Saugumo aspektai

Nors genų terapija regeneracijai yra daug žadanti, saugumas yra kritiškai svarbus. Tie patys augimo keliai, kurie padeda aksonams, taip pat gali sukelti problemų, jei jie paliekami nekontroliuojami. Kaip minėta, nuolatinis PTEN pašalinimas kelia vėžio riziką (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Panašiai, lėtinis mTOR aktyvinimas gali sukelti navikų augimą (pvz., TSC1/2 pacientams atsiranda navikai). Genų terapijos, kurios skatina augimo faktorius (pvz., inžinerinis RAS ar kiti onkogenai), turi būti kruopščiai kontroliuojamos. Pažymėtina, kad eksperimentinėje AAV-RAS terapijoje pelių akyse nebuvo pastebėta navikų (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), tačiau autoriai pabrėžia, kad reikia naudoti reguliuojamas (indukcines) sistemas, jei prireiktų išjungti bet kokią onkogeninę veiklą (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Kitos saugumo problemos apima ląstelių mirtį ir imunines reakcijas. Kai kurios intervencijos kenkia tam tikroms ląstelėms: pavyzdžiui, Sox11 pertekliaus ekspresija sunaikino daugelį alfa tipo TGL (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bet kokia terapija, kuri naikina TGL, panaikina jos naudą. Taip pat yra pažeidimo rizika nuo injekcijų ar uždegimo. Uždegimo sukėlimas (zimozanas) padėjo regeneracijai pelėms, tačiau žmonėms tai būtų pavojinga. Ilgalaikis AAV intarpų (pvz., įterpimo mutagenezės) poveikis yra nedidelis, tačiau bet kokia akių genų terapija reikalauja kruopštaus įvertinimo. Trumpai tariant, kiekvienas augimą skatinantis genas turi būti subalansuotas su galimu pažeidimu: idealu, kad jis būtų pristatomas laikinai arba griežtai kontroliuojamas.

Genų pristatymo strategijos

Genų pristatymas į tinkamas ląsteles yra pagrindinis iššūkis. TGL atveju, adeno-asocijuoti virusai (AAV) yra pagrindiniai vektoriai. AAV yra saugūs, nesidauginantys virusai, galintys nešti terapinius genus į tinklainės ląsteles. Dažnas metodas yra intrakamerinė injekcija: AAV tiesiogiai įšvirkščiamas į akies stiklakūnio gelį. AAV2 yra klasikinis serotipas tinklainės transdukcijai; jis efektyviai pasiekia TGL, kai injekuojamas intrakameriškai (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Iš tiesų, viename tyrime nustatyta, kad intrakamerinis AAV2 transdukavo daugiau nei 90% TGL (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Gali būti naudojami ir kiti kapsidai. Pavyzdžiui, AAV6, švirkščiamas intrakameriškai, rodo labai aukštą tropizmą vidinei tinklainei ir TGL sluoksniui (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Mokslininkai taip pat kuria AAV2 variantus (pvz., mutacijas ar chimeras), kad dar geriau pereitų tinklainės barjerus, tačiau šios detalės vis dar vystomos.

Kitas būdas yra suprachoroidinė injekcija, kai adata arba mikrokannulė pristato AAV tarp skleros ir choroido (kraujagyslių sluoksnio). Šis metodas plačiai paskleidžia vektorių po tinklaine. Suprachoroidinis AAV8 beždžionėms lėmė plačią genų ekspresiją (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tai galima atlikti specialiai suprojektuotomis mikroadatomis. Suprachoroidinis pristatymas leidžia išvengti didelės operacijos, tačiau vis dar yra invazinis ir gali sukelti vietinį uždegimą. Iš tiesų, suprachoroidinis AAV8 sukėlė lengvą choriretinitą (choroido uždegimą), kuriam prireikė steroidų, nors jis išsisprendė per kelias savaites (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Svarbu, kad suprachoroidinis pristatymas sukėlė silpnesnius sisteminius antikūnų atsakas prieš AAV kapsidą nei intrakamerinis pristatymas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tikėtina, kad taip yra todėl, kad kai kurie virusai skirtingai palieka akį. Apskritai, suprachoroidinė injekcija yra daug žadanti genų terapijai akies užpakalinei daliai, tačiau jos imuninis poveikis turi būti valdomas.

Imunogeniškumas

Nors akis yra tam tikra prasme „imunologiškai privilegijuota“, AAV genų pristatymas vis tiek gali sukelti imunines reakcijas. Intrakamerinis AAV dažnai išteka iš akies per drenažo kanalus. Viename tyrime su primatais nustatyta, kad intrakamerinis AAV sukėlė ~400–500 kartų daugiau viruso kraujyje, palyginti su subretinine injekcija (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tai sukėlė labai stiprų antikūnų atsaką prieš AAV kapsidą (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Priešingai, subretininis AAV (švirkščiamas po tinklaine) yra izoliuotas akyje ir paprastai sukelia beveik jokio antikūnų prieš kapsidą atsako (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprachoroidinis AAV yra tarpinis: dalis viruso lieka akyje, o dalis pasiekia aplinkinius audinius. Tyrimai rodo, kad suprachoroidinis AAV sukelia švelnesnę antikūnų prieš kapsidą gamybą nei intrakamerinis (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), tačiau jis gali stimuliuoti imunines ląsteles prieš genų produktą (kaip matoma su GFP), nes jis transdukuoja ląsteles už kraujo-tinklainės barjero (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Be antikūnų, T-ląstelių atsakai gali atakuoti transdukuotas ląsteles. Jei įterptas genas gamina baltymą, kurį organizmas laiko svetimu (kaip GFP eksperimentuose), imuninės ląstelės gali pašalinti tas ląsteles. Net ir tikri žmogaus genai kartais gali sukelti nedidelį uždegimą. Klinikiniai tinklainės genų tyrimai (pvz., RPE65) dažnai skiria steroidus, siekiant nuslopinti šį atsaką. Keliai, kurie lieka tinklainės viduje (subretininis, suprachoroidinis), paprastai yra mažiau imunogeniški nei intrakamerinės injekcijos (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ateities terapijos turės derinti efektyvų pristatymą su minimaliu imuniniu aktyvavimu, galbūt naudojant naujesnius AAV tipus arba imunosupresinius režimus.

Prisitaikymas prie glaukomos gydymo

Glaukoma kelia kitokį iššūkį nei ūmus nervo sutraiškymas. Esant glaukomai, TGL lėtai miršta dėl tokių veiksnių kaip didelis akispūdis, sumažėjęs kraujo tekėjimas ir stresas. Gydant glaukomą, genų terapija turi veikti lėtinio pažeidimo aplinkoje. Tai reiškia, kad laikas yra svarbus: terapijas gali reikėti skirti anksti, siekiant apsaugoti TGL, arba periodiškai, siekiant iš naujo sureguliuoti augimo signalus. Laimei, kai kurie darbai jau pradeda mažinti šį atotrūkį. Neseniai atliktame tyrime, mokslininkai naudojo AAV, kad pristatytų nuolat aktyvų TrkB receptorių (F-iTrkB) į glaukomos modelio pelių akis. Šios pelės parodė tiek TGL apsaugą, tiek didelę aksonų regeneraciją (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tai rodo, kad net esant glaukomos sąlygoms, augimo kelių aktyvinimas gali padėti.

Vis dėlto, pereinant nuo sutraiškymo modelių prie žmogaus glaukomos, reikės daugiau žingsnių. Turime išbandyti šias genų terapijas gyvūnų glaukomos modeliuose (pvz., sukeltos akies hipertenzijos ar genetinės), o ne tik sutraiškymo modeliuose. Taip pat turime atsižvelgti į senėjimą ir ligos aplinką: senesnius neuronus, randinį audinį ir svyruojantį akispūdį. Tikėtina, kad reikės derinti genų terapiją su standartine glaukomos priežiūra (slėgio mažinimu, neurotrofinių faktorių naudojimu) ir naudoti kontroliuojamas genų sistemas. Pavyzdžiui, kaip minėta, AAV konstrukcijos galėtų naudoti indukcinius promotorius, kad augimo faktoriaus genas galėtų būti išjungtas po to, kai aksonai ataugo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kadangi žmogaus glaukoma progresuoja lėtai, vienkartinės genų injekcijos gali nepakakti; gali prireikti pakartotinio dozavimo arba ilgalaikių vektorių. Apibendrinant, šių atradimų pritaikymas glaukomos terapijai reikš prisitaikymą prie lėtinės traumos dinamikos ir užtikrinimą, kad gydymas būtų saugus ir ilgalaikis.

Išvada

Genų terapija, moduliuojanti TGL vidinius kelius, rodo didelį potencialą: graužikams ji gali priversti regos nervą ataugti ir netgi atkurti dalį regėjimo. Pagrindinės strategijos, tokios kaip PTEN/mTOR aktyvinimas, KLF4 ištrynimas arba Sox11 pertekliaus ekspresija, kiekviena suteikia regeneracinį impulsą per skirtingas ląstelių programas. Pelių tyrimai patvirtina, kad aksonai gali iš naujo inervuoti smegenis ir pagerinti paprastas regos užduotis (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tačiau turi būti išspręstos saugumo problemos (onkogeninė rizika, ląstelių praradimas, imuninis atsakas) ir patobulinti pristatymo metodai. AAV vektorių ir akių injekcijų pažanga suteikia priemones efektyviai nukreipti TGL (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kiti žingsniai apima tyrimus lėtinės glaukomos modeliuose, dozavimo ir promotorių optimizavimą bei genų terapijos derinimo su glaukomos gydymu. Apskritai, ikiklinikiniai įrodymai tvirtai palaiko tolesnį vystymą: kruopščiai sureguliuodami vidinius augimo kelius, galime iš esmės pakeisti regos nervo atstatymo perspektyvas.