Ievads

Glaukoma ir galvenais neatgriezeniska akluma cēlonis visā pasaulē, jo iet bojā tīklenes gangliju šūnas (RGC), kas savieno aci ar smadzenēm, un tās nevar reģenerēties (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bez RGC redzes signāli no tīklenes nevar sasniegt smadzeņu centrus (piemēram, laterālo ceļgalu kodolu un augšējo kolikulu), tāpēc redze tiek zaudēta. Pašreizējās glaukomas ārstēšanas metodes (piemēram, intraokulārā spiediena pazemināšana) var aizsargāt izdzīvojušās RGC, bet nevar atjaunot jau zudušās (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cilmes šūnu terapijas mērķis ir aizstāt zudušās RGC, diferencējot cilvēka pluripotentas cilmes šūnas (vai nu embrionālās cilmes šūnas, EŠ, vai inducētās pluripotentas cilmes šūnas, iPŠ) RGC un transplantējot tās acī (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Principā tas varētu nodrošināt neierobežotu tīklenes neironu avotu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Taču šīs vīzijas realizēšanai ir jāpārvar milzīgi izaicinājumi: jaunajām RGC ir jāizdzīvo, to aksoniem jāaug cauri acs izejai (lamina cribrosa) redzes nervā, tie jāvada lielos attālumos uz precīziem smadzeņu mērķiem, jāveido funkcionālas sinapses un jāiegūst mielīna apvalks – tas viss pieaugušo centrālās nervu sistēmas inhibējošajā vidē.

Šajā rakstā aplūkots pašreizējais stāvoklis RGC iegūšanā no cilvēka cilmes šūnām un to transplantācijā dzīvnieku modeļos. Pēc tam mēs apspriežam kritiskos šķēršļus panākumiem – aksonu pagarināšanos cauri lamina cribrosa, vadīšanos uz talāmiskajiem un kolikulārajiem mērķiem, sinapses veidošanos un mielinizāciju –, kā arī drošības jautājumus (imūnās atgrūšanas risks, audzēja risks) un ievadīšanas metodes (intravitreāla pret subretinālu injekciju). Visbeidzot, mēs sniedzam reālistisku prognozi par to, kad “pirmie izmēģinājumi ar cilvēkiem” glaukomas gadījumā varētu būt iespējami un kādi rezultātu rādītāji tiem būtu nepieciešami. Visā tekstā mēs cenšamies pēc skaidrības: galvenie termini ir izcelti treknrakstā, un visi tehniskie jēdzieni ir izskaidroti plašai auditorijai.

RGC diferencēšana no cilvēka pluripotentas cilmes šūnām

Zinātnieki ir izstrādājuši daudzus protokolus, lai pārvērstu cilvēka EŠ vai iPŠ par RGC līdzīgiem neironiem. Parasti cilmes šūnas vispirms tiek vadītas tīklenes priekšteču stāvoklī, izmantojot augšanas faktoru un mazu molekulu kombinācijas, kas atdarina acu attīstību (piemēram, FGF, IGF, BMP, Wnt un Notch ceļa modulatori) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Piemērotos apstākļos šīs šūnas turpinās diferencēties RGC, ko var apstiprināt ar RGC marķieriem. Galvenie marķieri ietver transkripcijas faktorus BRN3B (POU4F2) un ISL1, RNS saistošo proteīnu RBPMS, neironu citoskeleta proteīnu β-III tubulīnu (TUJ1) un sinukleīnu-γ (SNCG). Patiešām, viens pētījums parādīja, ka no PSC iegūtas kultūras ekspresē vairākus RGC marķierus: “transkripcijas faktori, piemēram, BRN3, ISL1 un SNCG” parādījās kopā ar gariem neirītiem, apstiprinot RGC identitāti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šīs cilmes šūnu RGC pēc gēnu ekspresijas un morfoloģijas atgādina to dabiskos analogus, izstiepjot garus izaugumus un ģenerējot darbības potenciālus.

RGC nav viendabīgs šūnu tips. Pastāv desmitiem RGC apakštipu (piemēram, kustībai jutīgas virziena selektīvās šūnas, ieslēgšanās/izslēgšanās centra šūnas, iekšēji fotosensitīvās melanopsīna šūnas, alfa-RGC utt.), katram no tiem ir atšķirīgas funkcijas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pētījumos ar dzīvniekiem ir katalogēti vairāk nekā 30 RGC apakštipi pēc anatomijas un molekulārajiem marķieriem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), un pierādījumi liecina, ka cilvēkiem ir aptuveni 20 vai vairāk apakštipu ar unikālām savienojamībām (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teorētiski cilmes šūnu protokolus varētu pielāgot, lai ražotu specifiskus apakštipus, pielāgojot attīstības signālus. Praksē lielākā daļa pašreizējo metožu mērķis ir jaukta RGC populācija. Pēc tam pētnieki pārbauda apakštipu daudzveidību, veicot marķieru kombināciju koproben: piemēram, vienā pētījumā par cilvēka RGC diferenciāciju viņu BRN3+ šūnās tika identificētas kandidātu ieslēgšanās-izslēgšanās virziena selektīvās RGC (kas ekspresē CART) un alfa-RGC (kas ekspresē SPP1/osteopontīnu) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Apakštipu specifikācijas optimizācija ir aktīva pētījumu joma, jo katram RGC apakštipam (ar saviem pirms- un pēcsinaptiskajiem partneriem) būs nepieciešama atbilstoša integrācija in vivo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

RGC ģenerēšanas efektivitāte un ātrums ir uzlabojies. Agrīnie protokoli prasīja vairākas nedēļas vai mēnešus, bet jaunākas metodes paātrina procesu. Piemēram, Luo et al. inženierizēja transkripcijas faktora NGN2 pārākspresiju kopā ar neirotrofu vidi, lai radītu RGC līdzīgus neironus tikai divās nedēļās, salīdzinot ar 1-2 mēnešiem agrākajās 2D vai 3D kultūrās (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šīs šūnas ekspresēja RGC marķierus un, transplantētas pieaugušo žurku acīs, “vienas nedēļas laikā veiksmīgi migrēja uz gangliju šūnu slāni” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Līdzīgi pluripotentas cilmes šūnas, kas audzētas kā 3D tīklenes organoīdi (kas atkārto acu attīstību), dabiski veido RGC kopā ar citiem tīklenes neironiem. No organoīdiem iegūtās RGC parasti ir tuvākas augļa RGC gēnu ekspresijas profiliem nekā 2D kultūras, un daudzas grupas tagad vāc ar RGC bagātinātas šūnas no organoīdiem transplantācijas eksperimentiem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Neskatoties uz šo progresu, ražība joprojām ir pieticīga, un kultūras ir neviendabīgas. Protokoli bieži ražo jaukta tīklenes šūnu populāciju ar nelielu RGC daļu, un izdzīvošana kultūrā var būt ierobežota (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pētnieki parasti izmanto šūnu šķirošanu (piemēram, Thy1 vai BRN3 reportierus), lai attīrītu RGC pirms transplantācijas. Galvenais mērķis ir panākt ļoti augstu tīrību, jo jebkurš nediferencēts vai ārpusmērķa šūnu skaits rada audzēju veidošanās risku. Jauns pētījums brīdināja, ka “translācijas pētījumiem būs kritiski svarīgi noteikt donoru RGC tīrību, lai samazinātu teratomas veidošanās risku” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Transplantācija dzīvnieku modeļos: izdzīvošana un integrācija

Vairāki preklīniskie pētījumi tagad ir pārbaudījuši cilvēka cilmes šūnās iegūtās RGC dzīvnieku modeļos. Mērķi ietver demonstrāciju, ka transplantētās RGC var izdzīvot, integrēties saimniekorganisma tīklenē, izstiept aksonus un (galu galā) pārraidīt signālus. Eksperimenti galvenokārt ir veikti ar grauzējiem (pelēm, žurkām), bet arī ar lielākiem dzīvniekiem (kaķiem) un primātiem, kas nav cilvēki.

Pēc RGC diferencēšanas vai izolēšanas in vitro, pētnieki tās ievada saimniekorganisma acī. Divas galvenās stratēģijas ir intravitreāla injekcija (šūnu injicēšana stikla ķermenī, acs iekšējā dobumā) vai subretināla ievadīšana (šūnu ievietošana zem tīklenes). Rezultāti atšķiras:

- Intravitreāla injekcija ir tehniski vienkārša RGC mērķēšanai (kas atrodas uz iekšējās tīklenes virsmas). Vairākas grupas ir injicējušas cilvēka RGC vai no tīklenes organoīdiem iegūtu RGC suspensiju grauzēju stikla ķermenī. Piemēram, Vrathasha et al. injicēja apmēram 50 000 cilvēka iPSC-RGC intravitreāli WS pelēm un konstatēja, ka transplantētās šūnas atradās gangliju šūnu slānī un izdzīvoja vismaz piecus mēnešus pēc transplantācijas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šīs šūnas veidoja normālus dendrītu kokus un izraisīja gaismas vadītus darbības potenciālus, kas bija gandrīz identiski dabiskajām peles RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), pierādot, ka tās var funkcionāli integrēties vismaz tīklenē. Luo et al. (2020) līdzīgi parādīja, ka no hESC iegūtās RGC līdzīgās šūnas (ar NGN2 pārākspresiju) nedēļas laikā migrēja uz pieaugušo žurku gangliju slāni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šie rezultāti ir iepriecinoši, taču to šūnu skaits, kas patiešām integrējas, parasti ir mazs. Vrathasha ziņoja par vidēji ~672 izdzīvojušām donoru šūnām uz peles tīkleni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) – niecīga daļa no normāla RGC skaita –, izceļot izaicinājumu pilno vidi.

Viena problēma ar vienkāršām intravitreālām suspensijām ir tā, ka šūnas bieži vien salīp vai nespēj pielipt. Pētījumā ar kaķu RGC bojājuma modeli Becker et al. konstatēja, ka intravitreāla šūnu suspensijas injekcija izraisīja šūnu agregāciju un maz patiesas integrācijas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Viņi atzīmēja, ka karkasa izmantošana varētu uzlabot izdzīvošanu un tīklenes migrāciju. Patiešām, daži pētījumi tagad ievieto RGC biomateriālu karkasos vai organoīdu audos, lai tās atbalstītu. Piemēram, cilvēka tīklenes organoīdi (RGC ievākšana attīstības 60.–70. dienā) tika transplantēti subretināli kaķu acīs. Ar sistēmisku imūnsupresiju šie organoīdu transplantāti izdzīvoja vismaz 1 mēnesi un, šķiet, veidoja sinaptiskus kontaktus ar saimniekorganisma neironiem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Subretinālā pieeja nodrošināja stingru kontaktu starp donoru audiem un tīkleni, savukārt intravitreālās šūnu suspensijas mēdza peldēt vai salipt. No otras puses, subretinālā ievadīšana ir sarežģītāka operācija un to var ierobežot pieejamā telpa (subretinālā telpa ir plāna četrkājainajiem dzīvniekiem un primātiem).

Maziem grauzējiem intravitreāla ievadīšana joprojām ir visbiežāk izmantotā pieeja. Pēc injekcijas veiksmīgas donoru šūnas ir identificētas, migrējot uz saimniekorganisma tīklenes gangliju šūnu slāni un ekspresējot RGC marķierus (BRN3, RBPMS) nedēļām vai mēnešiem ilgi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Daži pētījumi ziņo, ka donoru šūnas izstiepj jaunus dendrītus un pat sākotnējos aksonu dīgstus redzes nerva diska virzienā. Piemēram, transplantētajām hiPSC-RGC pelēm bija sarežģīti dendrītu koki un (gaismas stimulācijas gadījumā) tika ģenerēti postsinaptiskie potenciāli, norādot, ka tās bija izveidojušas sinapses ar bipolārajām/amakrīnajām starpneironiem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tomēr ir svarīgi būt piesardzīgiem: pieredze ar fotoreceptoru transplantātiem liecina, ka pārnestie fluorescējošie marķieri dažkārt var radīt iespaidu, ka transplantētās šūnas ir integrējušās, lai gan patiesībā tās ir tikai nodevušas krāsvielu saimniekorganisma šūnām (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lai apstiprinātu patiesu integrāciju, nepieciešama rūpīga marķēšana un funkcionāla testēšana. Visos līdzšinējos gadījumos izdzīvo un integrējas tikai daļa injicēto RGC. Piemēram, Vrathasha et al. injicēja 500 000 šūnu, bet vēlāk pēc 5 mēnešiem izdzīvojušas tika saskaitītas tikai ~0,13% (aptuveni 650 šūnas) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Skaidrs, ka saimniekorganisma tīklenes vide rada spēcīgu selektīvu spiedienu, un izdzīvošana joprojām ir ierobežojošs faktors.

Ievadīšanas ceļi: intravitreāli pret subretināli

RGC ievadīšanas veida izvēlei acī ir praktiska un bioloģiska nozīme. Intravitreālās injekcijas ievieto šūnas acs gelā (stikla ķermenī) blakus tīklenei. Šis ceļš tieši mazgā iekšējo tīkleni, bet var arī pakļaut šūnas difūzijas izaicinājumiem (tām ir jāpielīp pie tīklenes virsmas, lai integrētos). Kā minēts iepriekš, šūnu suspensijas bez atbalsta var salipt; izdzīvošana var būt slikta, ja vien šūnas ātri nemigrē uz saimniekorganisma audiem. Vairākos pētījumos ir konstatēts, ka transplantāti, kas balstās uz karkasiem vai organoīdiem (nevis vienšūnu suspensijas), uzlabo rezultātus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Intravitreālai ievadīšanai ir salīdzinoši vienkāršas tehnikas priekšrocība (tā jau tiek izmantota zāļu injekcijām un gēnu terapijas vektoriem) un tieša RGC mērķēšana.

Turpretim subretināla ievadīšana (šūnu ievietošana starp tīkleni un tīklenes pigmenta epitēliju) tradicionāli tiek izmantota fotoreceptoru vai RPE transplantātiem. RGC transplantātiem tā ir mazāk intuitīva, bet var nodrošināt labvēlīgu kontaktu. Singh et al. pētījumā ar kaķiem cilvēka tīklenes organoīdi tika implantēti subretināli ar ciešu saskari ar saimniekorganisma tīkleni. Neskatoties uz nepieciešamību pēc imūnsupresijas, šie transplantāti izdzīvoja nedēļām ilgi un parādīja sinapses veidošanās pazīmes ar tīklenes gangliju šūnām (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Šaurā subretinālā telpa noturēja donoru šūnas vietā. Tomēr kaķiem un primātiem šī telpa ir ārkārtīgi plāna, kas apgrūtina mērķēšanu. Subretināla operācija arī rada lielāku risku saimniekorganisma tīklenei. Tādējādi intravitreāla injekcija joprojām ir standarta pieeja grauzējiem, savukārt subretinālās vai epiretīnas (uz tīklenes virsmas) stratēģijas var izpētīt lielākām acīm.

Rezumējot, intravitreāla injekcija ir visvieglākā, taču bieži vien prasa karkasus vai lielu šūnu skaitu, lai nodrošinātu jebkādu izdzīvošanu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Subretinālie transplantāti/klasteri var nodrošināt stingru kontaktu (kā Singh kaķu pētījumā (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)), taču rada ķirurģiskus izaicinājumus. Tiek pētīti abi ceļi, un ir iespējams, ka nākotnes protokoli apvienos šūnu iegremdēšanu bioloģiski saderīgos karkasos vai gēlos, lai maksimāli palielinātu donora un saimniekorganisma saskares virsmu.

Šķēršļi aksonu reģenerācijai un savienojamībai

Pat ja transplantētās RGC izdzīvo un ieņem vietu acī, lieli šķēršļi bloķē to spēju pārraidīt redzi uz smadzenēm. Normālā (pieaugušo) centrālajā nervu sistēmā bojātas redzes nerva šķiedras nereģenerējas labi. Transplantētās RGC saskaras ar to pašu naidīgo vidi. Galvenie šķēršļi ir:

Aksonu augšana caur Lamina Cribrosa

Lamina cribrosa ir sietam līdzīga struktūra redzes nerva diskā, kur RGC aksoni iziet no acs. Tas ir liels šķērslis atjaunošanai. Eksperimentos ar dzīvniekiem pētnieki atklāj, ka tikai daži transplantēto RGC aksoni šķērso šo barjeru. Viens rūpīgs pētījums ziņoja, ka “kad RGC tika injicētas stikla ķermenī, maz integrējās tīklenē. No tām RGC, kas veiksmīgi integrējās GCL, daudzi izveidoja aksonus, kas auga redzes nerva diska virzienā, taču tikai daži izauga cauri lamina cribrosa (~10%)” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Citiem vārdiem sakot, 90% jauno aksonu apstājās pie lamina. Lamina satur blīvu glia un ekstracelulāro matricu, kas, visticamāk, rada inhibējošus signālus un fiziskus šķēršļus. Šī ceļa šķēršļa pārvarēšana varētu prasīt vai nu donoru aksonu inženieriju (piemēram, palielinot progredēšanas ceļus, piemēram, mTOR vai Wnt), vai lamina vides modificēšanu (piemēram, enzīmu lietošanu vai inhibējošo molekulu neitralizēšanu). Šī problēma ir analoga jebkuram muguras smadzeņu ievainojumam: CNS īpašība, ka aksonu reģenerācija neizdodas. Tas liecina, ka pat tad, ja mēs ievietojam RGC acī, to aksonu iekļūšanai redzes nervā būs nepieciešami ļoti spēcīgi pro-reģeneratīvi stimuli.

Vadīšana uz smadzeņu mērķiem

Pieņemot, ka RGC aksoni var iziet no acs, nākamais izaicinājums ir aksonu vadīšana lielos attālumos uz pareizajiem mērķiem (galvenokārt laterālo ceļgalu kodolu (LGN) talamusā un augšējo kolikulu vidussmadzenēs). Attīstības laikā RGC aksoni tiek vadīti ar molekulāriem gradientiem (piemēram, efrīna-A/EphA proteīniem) un spontānu tīklenes aktivitāti. Pieaugušo smadzenēm parasti trūkst šo signālu. Daži pētījumi ar grauzējiem ir parādījuši, ka ir iespējams novirzīt reģenerējošus RGC aksonus, lai tie atjaunotu savienojumu ar augšējo kolikulu: piemēram, vienā optiskā trakta bojājuma modelī tika palielināta augšanas gēnu (mTOR, JAK/STAT) ekspresija un tika novērotas jaunas sinapses kolikulā (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tomēr šie reģenerētie aksoni neatjaunoja redzi, ja vien tie netika mākslīgi atbalstīti (skatīt mielinizāciju zemāk). Īsumā, pareizo vadīšanas signālu atrašana (vai to nodrošināšana) ir atklāts pētījumu jautājums. Transplantēto RGC aksoni ideālā gadījumā atkārtotu embrionālos vadīšanas signālus, lai smadzenēs izveidotu pareizu retinotopu karti, taču joprojām nav skaidrs, kā to panākt pieaugušajiem.

Sinapses veidošanās

Jauniem aksoniem galu galā ir jāveido sinapses ar pareizajiem mērķa neironiem. Iepriecinoši, pierādījumi liecina, ka transplantētās RGC var veidot sinaptiskus savienojumus vismaz tīklenē. Johnson et al. pētījumā hiPSC-atvasinātās RGC, kas migrēja uz saimniekorganisma GCL, izveidoja normālus dendrītu kokus. Izmantojot sinaptisko marķieru krāsošanu un gaismas stimulāciju, autori “demonstrēja jaunu un funkcionālu sinapšu veidošanos starp donoru RGC un saimniekorganisma tīkleni” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Citiem vārdiem sakot, transplantētās RGC spēja savienoties ar bipolārajām/amakrīnajām starpneironiem un pārraidīt signālus tālākajām saimniekorganisma šūnām, lai gan reakcijas bija nedaudz vājākas nekā dabiskajām šūnām. Šis atklājums norāda, ka vismaz iekšējās tīklenes līmenī var notikt atbilstoša vadu izvietošana.

Sinapses veidošanos smadzenēs ir vēl grūtāk panākt un izmērīt. Daži reģenerācijas pētījumi (nevis transplantācijas pētījumi per se) ir inducējuši RGC aksonus atjaunoties kolikula virzienā un veidot sinapses (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Iepriekš minētajā optiskā trakta bojājuma modelī jaunie aksoni suprahiazmālajā/kolikulārajā reģionā patiešām veidoja sinapses, taču pelēm joprojām nebija mērāmas vizuālās uzvedības. Tas vēlāk tika attiecināts uz mielīna trūkumu (skatīt nākamo sadaļu), nevis uz kļūdainām sinapsēm (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Būtība: Sinaptogenēze principā ir iespējama, taču nodrošināt robustas, precīzi mērķētas sinapses, kas atjaunotu redzi, ir liels šķērslis. Tas, visticamāk, prasīs “attīstībai līdzīgus” signālus, piemēram, veidotu gaismas stimulāciju (tīklenes viļņus) vai atbalstošo glia šūnu koplantāciju, lai vadītu un stiprinātu jaunus savienojumus.

Reģenerēto aksonu mielinizācija

Visbeidzot, RGC aksoni parasti mielinizējas tikai pēc tam, kad tie ir izgājuši cauri lamina cribrosa – interesanta acs uzbūves īpatnība. Oligodendrocīti (CNS mielinizējošās šūnas) tiek turētas ārpus tīklenes ar lamina palīdzību (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Ja transplantētas RGC aksoni iziet no acs, tie nonāk CNS, kur ir mielinizējošā glia. Tomēr daudzos eksperimentālos gadījumos jaunie aksoni paliek nemielinizēti. Tam ir nozīme, jo nemielinizēti gari CNS aksoni ļoti vāji vada impulsus. Optiskā trakta reģenerācijas pētījumā (aprakstīts iepriekš) autori konstatēja, ka jaunizveidotie aksoni bija nemielinizēti, un pelēm nebija novērojama redzes uzlabošanās, ja vien tām netika dots 4-aminopiridīns (4-AP) – zāles, kas bloķē kālija kanālus un pastiprina vadītspēju demielinizētās šķiedrās (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Faktiski 4-AP daļēji atjaunoja redzi, kompensējot mielīna trūkumu. Šis rezultāts uzsver faktu: pat ja RGC aksoni sasniedz savu mērķi, bez mielīna tie nevadīs signālus pietiekami ātri redzei. Būs izšķiroši svarīgi nodrošināt pareizu mielinizāciju – iespējams, koplantējot oligodendrocītu priekštečus vai stimulējot saimniekorganisma glia šūnas.

Rezumējot, transplantētās RGC saskaras ar šķēršļu joslu: tikai daži izaug cauri lamina cribrosa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), tām ir jāatrod pareizais koridors uz smadzeņu mērķiem, jāizveido atbilstošas sinapses un pēc tam jāapvalko mielīnā. Katrā posmā pašlaik ir tikai daļēji panākumi dzīvnieku modeļos. Šo šķēršļu pārvarēšana ir aktīva neiroreģenerācijas pētījumu joma.

Imūnās un drošības problēmas

Acs ir salīdzinoši imūnprivileģēta, taču šūnu transplantācija joprojām rada imūnuzbrukuma risku. Ja donoru šūnas ir autologas (no pacienta paša iPŠ), atgrūšana ir minimāla, bet tehniskā sarežģītība ir augsta. Aloģeniskās šūnas (no cita donora vai cilmes šūnu līnijas) ir vieglāk ražojamas, taču tās var tikt uzbrukušas saimniekorganisma imūnsistēmai. Pētījumos ar dzīvniekiem pētnieki bieži izmanto imūnsupresīvus medikamentus, lai veicinātu transplantāta izdzīvošanu. Piemēram, kaķu organoīdu transplantācijas pētījumā bija nepieciešama sistēmiska imūnsupresija, lai transplantāts izdzīvotu un veidotu savienojumus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bez imūnsupresijas ksenoģenētiskās šūnas tiek ātri izvadītas. Interesanti, ka lielākā daļa preklīnisko pētījumu par tīklenes transplantātiem ziņo tikai par zema līmeņa iekaisumu, nevis pilnīgu atgrūšanu – tas ir acs barjeru ieguvums (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tomēr ilgtermiņa panākumiem, visticamāk, būs nepieciešama vai nu īslaicīga imūnsupresija, vai progresīvas metodes (piemēram, šūnu “slēpšana” ar imūneskapējošiem pārklājumiem) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jebkurā nākotnes izmēģinājumā ar cilvēkiem būtu jārisina šis jautājums, lai donoru RGC netiktu iznīcinātas ar saimniekorganisma T-šūnām.

Saistīta problēma ir audzēju veidošanās. Pluripotentas cilmes šūnas var veidot teratomas, ja tiek transplantētas nediferencētas šūnas. Pat neliels skaits piesārņojošo PSC RGC preparātā varētu būt katastrofāls. Tādējādi pētnieki uzsver transplantētās populācijas augstu tīrību. Vrathasha et al. atzīmē, ka ir “kritiski svarīgi noteikt donoru RGC tīrību, lai samazinātu teratomas veidošanās risku” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tas prasa rūpīgu kvalitātes kontroli – piemēram, šūnu šķirošanu, izmantojot RGC specifiskus reportierus vai plūsmas citometriju, un testēšanu ar genoma metilēšanas vai gēnu ekspresijas analīzēm, lai nodrošinātu, ka nepaliek pluripotentas šūnas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Līdz šim dzīvnieku RGC transplantācijas eksperimentos nav ziņots par audzējiem, taču klīniskā translācija prasīs ārkārtīgi stingru jebkura cilmes šūnu produkta attīrīšanu un atbrīvošanas testēšanu.

Perspektīva: ceļā uz cilvēku pētījumiem glaukomas ārstēšanā

Ņemot vērā iepriekš minētos milzīgos izaicinājumus, kad varētu pamatoti sagaidīt pirmo klīnisko pētījumu par RGC aizstāšanu glaukomas pacientiem? Diemžēl atbilde, visticamāk, ir “drīz ne”. Joma joprojām ir agrīnā preklīniskā stadijā (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Līdz šim nav reģistrēts neviens cilvēku pētījums, kas būtu īpaši paredzēts RGC transplantācijai glaukomas ārstēšanā. Esošās “cilmes šūnu klīnikas” (piemēram, maldinoši pētījumi ar autologām tauku vai kaulu smadzeņu šūnām) ir koncentrējušās uz ad hoc pieejām un, kas ir uzkrītoši, ir radījušas kaitējumu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pacientiem vajadzētu būt piesardzīgiem pret nepārbaudītām terapijām, kas apiet FDA uzraudzību. Likumīgi “pirmie pētījumi ar cilvēkiem” prasītu pārliecinošus pierādījumus par koncepciju dzīvniekos, risinot katru šķērsli, un pārliecinošus drošības datus. Tas varētu ilgt daudzus gadus.

Pragmatiska perspektīva ir tāda, ka mazi drošības pētījumi varētu sākties 2020. gadu beigās vai 2030. gados, ja progress turpināsies. Kandidāti, visticamāk, būtu pacienti ar ļoti progresējušu slimību (kur tīklene un redzes nervs var būt lielā mērā atvienoti), vai otrādi – tie, kas atrodas vidējā slimības stadijā (lai maksimāli palielinātu jebkāda ieguvuma iespējamību). Primārie mērķpunkti sākotnēji būtu drošība: nevēlamu iekaisuma reakciju vai audzēju veidošanās neesamība acī. Sekundārie mērķpunkti būtu vērsti uz jebkādu anatomisku vai funkcionālu transplantāta “pieķeršanās” pazīmju noteikšanu. Piemēram, tīklenes attēlveidošana (optiskā koherences tomogrāfija) varētu meklēt tīklenes nervu šķiedru slāņa vai gangliju šūnu slāņa sabiezējumu vietā, kur tika injicētas šūnas. Elektrofizioloģiskie testi, piemēram, paterna elektroretinogramma (PERG) vai vizuāli izsauktie potenciāli (VEP), varētu atklāt elektriskās atbildes, kas rodas no transplantētajām šūnām. Galu galā funkcionālās redzes pārbaudes (piemēram, redzes lauki vai kontrasta jutība) būtu svarīgas, taču pat maza redzes loka atjaunošanas demonstrēšana būtu revolucionāra. Pēc analoģijas, nesenie gēnu terapijas pētījumi iedzimtu tīklenes slimību gadījumā mēra rezultātus strukturālajās pret funkcionālajām kategorijās (pmc.ncbi.nlm.nih.gov); tiktu piemērotas līdzīgas kategorijas (OCT anatomija, elektrofizioloģija, redzes funkcija, pacienta ziņotā redze).

Rezumējot, lai gan ir piesardzīgs optimisms, jebkurš praktisks termiņš ir ilgs. Katrs no iepriekš aprakstītajiem soļiem prasa uzlabojumus. Reālistisks pirmais pētījums varētu tikt izstrādāts 2030. gadu vidū vai beigās, atkarībā no sasniegumiem aksonu reģenerācijā un drošības profilos. Kandidāti un mērķpunkti tiktu izvēlēti rūpīgi: visticamāk, vispirms drošības mērķpunkti, kam sekotu integrācijas surogāti (attēlveidošana, elektrofizioloģija), pirms sagaidīt mērāmus redzes uzlabojumus. Citiem vārdiem sakot, jomai ir jāsabalansē cerība ar reālismu – RGC aizstāšana būs pētījumu maratons, nevis ātrs sprints.

Secinājums

Zaudēto RGC aizstāšana glaukomas gadījumā ar laboratorijā audzētiem analogiem ir aizraujoša, bet vēl agrīna ideja. In vitro cilvēka pluripotentas cilmes šūnas var pārvērst RGC līdzīgās šūnās, kas ekspresē galvenos marķierus un pat dažas apakštipu īpašības (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Transplantācijas pētījumi ar dzīvniekiem ir parādījuši, ka daļa šo šūnu var izdzīvot mēnešiem ilgi, integrēties tīklenes shēmā un potenciāli veidot sinapses (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tomēr joprojām ir milzīgi šķēršļi. Aksonu augšana ārpus lamina cribrosa ir vāja (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), vadīšana uz centrālajiem mērķiem nav pietiekami kontrolēta, sinapses ir vājas vai nav vispār, un aksoniem trūkst mielīna (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Turklāt ir jārisina imūnās atgrūšanas un audzēju riski. Pašlaik pētnieki turpina risināt katru izaicinājumu pēc kārtas. Kamēr mēs nevarēsim uzticami audzēt, ievadīt un savienot cilmes šūnu RGC, redzi atjaunojošās transplantācijas paliks laboratorijā. Tomēr pastāvīgais progress dod cerību: ar nepārtrauktām inovācijām un piesardzību sapnis par “Petri trauciņš līdz redzes traktam” RGC aizstāšanu kādu dienu var pārvērsties no eksperimenta par ārstēšanu.