Introduzione

La perdita della vista dovuta a lesioni del nervo ottico o a glaucoma si verifica perché le cellule gangliari retiniche (RGC) non riescono a rigenerare i loro assoni. Nei mammiferi adulti, il programma di crescita intrinseca delle RGC è normalmente disattivato, quindi i nervi danneggiati non guariscono da soli (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Recenti studi sui topi dimostrano che la terapia genica può riattivare queste vie di crescita. Ad esempio, la delezione del gene PTEN (un freno alla crescita cellulare) nelle RGC adulte attiva la via di crescita mTOR e porta a una forte ricrescita degli assoni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). In questo articolo esaminiamo come la manipolazione di PTEN/mTOR, dei geni della famiglia KLF e di Sox11 possa stimolare la rigenerazione assonale delle RGC, cosa è stato ottenuto nei topi, le questioni di sicurezza (come il rischio di cancro), come vengono somministrati i geni (vettori virali AAV, iniezione intravitreale o sovracoroidale) e quali passaggi sono necessari per passare dai modelli di lesione acuta al trattamento del glaucoma cronico.

Vie di Crescita Intrinseche nelle RGC

Via PTEN/mTOR

In condizioni normali, le RGC adulte mantengono la via mTOR ampiamente disattivata, il che limita la loro capacità di far crescere nuovi assoni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN è un gene che inibisce mTOR. Gli scienziati hanno scoperto che la rimozione di PTEN nelle RGC adulte di topo scatena la segnalazione di mTOR e consente la ricrescita degli assoni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). In uno studio fondamentale, il knockout condizionale di PTEN in topi adulti ha portato a una rigenerazione robusta del nervo ottico (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Circa l'8-10% delle RGC sopravvissute ha esteso gli assoni per oltre 0,5 mm oltre la lesione, con alcuni assoni che sono cresciuti oltre 3 mm e hanno persino raggiunto il chiasma ottico entro 4 settimane dalla lesione (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). L'eliminazione di un altro freno di mTOR, il gene TSC1, ha anche indotto la ricrescita degli assoni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

La delezione di PTEN non solo ha stimolato la ricrescita, ma ha anche migliorato la sopravvivenza delle RGC (circa il 45% di sopravvivenza contro ~20% nei controlli) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tuttavia, esiste una preoccupazione per la sicurezza: PTEN è un soppressore tumorale. La perdita a lungo termine di PTEN può promuovere la crescita cellulare incontrollata. Infatti, un importante studio sulla rigenerazione ha osservato che la delezione permanente di PTEN sarebbe clinicamente inaccettabile a causa del rischio di cancro (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Per affrontare questo problema, i ricercatori suggeriscono di utilizzare una terapia genica controllabile (ad esempio, shRNA veicolato da AAV sotto un promotore commutabile) in modo che l'attività di PTEN possa essere disattivata durante la ricrescita e poi riattivata (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). In sintesi, PTEN/mTOR è un potente interruttore di crescita interno, ma deve essere attentamente controllato.

Famiglia KLF e Sox11

I ricercatori hanno anche mirato a fattori di trascrizione che controllano la crescita assonale. I fattori simili a Krüppel (KLF) sono una famiglia di tali geni. Una scoperta chiave è che KLF4 agisce come un freno alla crescita assonale: le RGC prive di KLF4 crescono meglio del normale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nei topi ingegnerizzati in modo che le RGC non avessero KLF4, questi neuroni hanno esteso neuriti molto più lunghi in coltura e, dopo la lesione del nervo ottico, molti più assoni sono cresciuti. Ad esempio, due settimane dopo la lesione, i topi knockout per KLF4 avevano significativamente più fibre in rigenerazione oltre 1 mm dal sito della lesione rispetto ai topi wild-type (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Altri KLF hanno ruoli vari: alcuni (come KLF6 e KLF7) promuovono la crescita, mentre altri (come KLF9) la sopprimono (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pertanto, il riequilibrio dell'espressione di KLF può rimuovere alcuni dei “freni” dello sviluppo sulla crescita delle RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Un altro fattore di trascrizione è Sox11, importante nello sviluppo. L'iperespressione di Sox11 nelle RGC adulte (utilizzando la veicolazione genica con AAV) ha anche dimostrato di stimolare la rigenerazione. In uno studio, le RGC con Sox11 extra hanno mostrato un marcato aumento della ricrescita assonale dopo la lesione (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tuttavia, Sox11 ha effetti contrastanti: promuove la ricrescita in alcuni tipi di RGC ma può ucciderne altri. In particolare, l'iperespressione di Sox11 ha ucciso quasi tutte le cosiddette RGC “alfa” (un sottotipo di RGC) che di solito rispondono bene ai trattamenti basati su PTEN (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). In altre parole, Sox11 riprogramma alcune RGC in uno stato competente per la crescita, ma ne danneggia anche altre (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Gli scienziati concludono che diversi sottotipi di RGC richiedono diverse strategie di ricrescita.

Studi Chiave sulla Lesione del Nervo Ottico nei Topi

I modelli murini di lesione del nervo ottico (schiacciamento del nervo ottico) hanno mostrato come queste manipolazioni geniche funzionano in pratica. Un approccio classico ha combinato più vie per un effetto massimo. In uno studio PNAS, gli scienziati hanno applicato tre trattamenti: delezione di PTEN, induzione di infiammazione nell'occhio (zimogeno) ed elevazione di cAMP. Questo trio ha indotto le RGC a rigenerare gli assoni per tutta la lunghezza del nervo ottico e nei centri visivi del cervello (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Quando hanno esaminato i cervelli dei topi trattati, molte fibre in rigenerazione hanno raggiunto il nucleo genicolato laterale, il collicolo superiore e altre aree visive (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). È importante sottolineare che questa ricrescita ha portato a un recupero parziale dei comportamenti legati alla vista. I topi trattati hanno riacquistato una certa capacità di eseguire semplici compiti visivi: potevano seguire schemi in movimento (un riflesso optomotorio) e giudicare la profondità meglio dei controlli feriti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Hanno persino mostrato migliori risposte alla luce circadiana [20†L33-L38], sebbene questi dettagli possano essere difficili da misurare.) Questo lavoro ha dimostrato che la rigenerazione assonale a lunga distanza nei topi adulti può ricollegare funzionalmente parti del sistema visivo.

Altri studi si sono concentrati su fattori individuali. La somministrazione intravitreale di un AAV che trasporta un TrkB costitutivamente attivo (un recettore del fattore neurotrofico derivato dal cervello) ha causato una crescita ancora più lunga. Ad esempio, Nishijima et al. hanno utilizzato un TrkB ingegnerizzato (chiamato F-iTrkB) veicolato da AAV e hanno osservato la ricrescita degli assoni per oltre 4,5 mm, con alcuni che hanno raggiunto il chiasma ottico (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Allo stesso modo, l'introduzione di un gene che promuove la crescita come il K-Ras attivo (un noto oncogene) nelle RGC ha prodotto circa 3 mm di rigenerazione (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). È interessante notare che non sono stati osservati tumori negli occhi trattati, ma gli autori raccomandano comunque l'uso di interruttori genici on/off inducibili per motivi di sicurezza (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Questi e altri studi confermano che l'attivazione dei geni di crescita intrinseci può effettivamente guidare la rigenerazione nei modelli murini di lesione del nervo ottico.

Recupero Visivo Parziale

Gli esperimenti sui topi hanno spesso tracciato non solo l'anatomia ma anche la funzione. Il riflesso optomotorio (topi che seguono strisce in movimento) e i test di percezione della profondità sono modi semplici per vedere se la vista migliora. Nello studio a triplo trattamento (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), i topi hanno mostrato un ripristino parziale di questi riflessi. Potevano nuovamente rispondere a stimoli visivi in movimento e giudicare la profondità, mentre i topi feriti senza trattamento non potevano farlo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Questo è incoraggiante: significa che gli assoni rigenerati hanno stabilito connessioni utili. Tuttavia, il recupero è stato solo parziale. Molte vie visive (soprattutto la visione fine che forma immagini) rimangono disconnesse. Finora, la rigenerazione ha ripristinato le risposte visive di base, ma non la visione completa. Tuttavia, qualsiasi guadagno funzionale conferma il potenziale di queste strategie.

Considerazioni sulla Sicurezza

Sebbene la terapia genica per la rigenerazione sia promettente, la sicurezza è una preoccupazione critica. Le stesse vie di crescita che aiutano gli assoni possono anche causare problemi se lasciate incontrollate. Come notato, la delezione permanente di PTEN comporta un rischio di cancro (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Allo stesso modo, l'attivazione cronica di mTOR può portare alla crescita tumorale (ad esempio, i pazienti con TSC1/2 sviluppano tumori). Le terapie geniche che promuovono fattori di crescita (come RAS ingegnerizzato o altri oncogeni) devono essere attentamente controllate. In particolare, nella terapia sperimentale AAV-RAS non sono stati osservati tumori negli occhi dei topi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ma gli autori sottolineano la necessità di utilizzare sistemi regolati (inducibili) nel caso in cui qualsiasi attività oncogenica debba essere disattivata (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Altri problemi di sicurezza includono la morte cellulare e le reazioni immunitarie. Alcuni interventi danneggiano determinate cellule: ad esempio, l'iperespressione di Sox11 ha ucciso molte RGC di tipo alfa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Qualsiasi terapia che uccide le RGC vanifica il suo beneficio. Esiste anche il rischio di danni da iniezioni o infiammazioni. Indurre l'infiammazione (zimogeno) ha aiutato la rigenerazione nei topi, ma negli esseri umani sarebbe pericoloso. Gli effetti a lungo termine degli inserti AAV (come la mutagenesi inserzionale) sono bassi, ma qualsiasi terapia genica oculare richiede un'attenta valutazione. In breve, ogni gene che promuove la crescita deve essere bilanciato rispetto ai potenziali danni: idealmente somministrato in modo transitorio o sotto stretto controllo.

Strategie di Veicolazione Genica

L'introduzione dei geni nelle cellule giuste è una sfida fondamentale. Per le RGC, i virus adeno-associati (AAV) sono i vettori di elezione. Gli AAV sono virus sicuri, non replicanti, in grado di trasportare geni terapeutici nelle cellule retiniche. Un metodo comune è l'iniezione intravitreale: iniettare l'AAV direttamente nel gel vitreale dell'occhio. L'AAV2 è il sierotipo classico per la trasduzione retinica; raggiunge efficacemente le RGC quando iniettato per via intravitreale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Infatti, uno studio ha rilevato che l'AAV2 intravitreale trasduceva oltre il 90% delle RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Possono essere utilizzati anche altri capsidi. Ad esempio, l'AAV6 somministrato per via intravitreale mostra un tropismo molto elevato per la retina interna e lo strato di RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Gli scienziati stanno anche ingegnerizzando varianti di AAV2 (come mutazioni o chimere) per attraversare ancora meglio le barriere retiniche, ma questi dettagli sono in evoluzione.

Un'altra via è l'iniezione sovracoroidale, dove un ago o una microcannula rilascia l'AAV tra la sclera e la coroide (lo strato vascolare). Questo approccio diffonde ampiamente il vettore sotto la retina. L'AAV8 sovracoroidale nelle scimmie ha portato a un'ampia espressione genica (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Può essere eseguita con microneedle appositamente progettati. La somministrazione sovracoroidale evita interventi chirurgici importanti ma è comunque invasiva e può causare infiammazione locale. Infatti, l'AAV8 sovracoroidale ha causato una lieve corioretinite (infiammazione della coroide) che ha richiesto steroidi, sebbene si sia risolta in settimane (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). È importante sottolineare che la somministrazione sovracoroidale ha innescato risposte anticorpali sistemiche più deboli al capside AAV rispetto alla somministrazione intravitreale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ciò è probabilmente dovuto al fatto che parte del virus sfugge dall'occhio in modo diverso. Nel complesso, l'iniezione sovracoroidale mostra promettenti applicazioni per la terapia genica nella parte posteriore dell'occhio, ma i suoi effetti immunitari richiedono gestione.

Immunogenicità

Anche se l'occhio è in qualche modo “privilegiato dal punto di vista immunitario”, la somministrazione genica con AAV può comunque provocare reazioni immunitarie. L'AAV intravitreale spesso fuoriesce dall'occhio attraverso i canali di drenaggio. Uno studio sui primati ha rilevato che l'AAV intravitreale ha prodotto ~400-500 volte più virus nel flusso sanguigno rispetto all'iniezione sottoretinica (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ciò ha causato una risposta anticorpale molto forte contro il capside AAV (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Al contrario, l'AAV sottoretinico (iniettato sotto la retina) è sequestrato nell'occhio e tipicamente non provoca quasi nessuna produzione di anticorpi anti-capside (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). L'AAV sovracoroidale si trova nel mezzo: parte del virus rimane nell'occhio mentre parte raggiunge i tessuti vicini. Gli studi dimostrano che l'AAV sovracoroidale provoca una produzione di anticorpi anti-capside più lieve rispetto all'intravitreale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ma può stimolare le cellule immunitarie contro il prodotto genico (come visto con la GFP) perché trasduce cellule al di fuori della barriera emato-retinica (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

In aggiunta agli anticorpi, le risposte delle cellule T possono attaccare le cellule trasdotte. Se il gene inserito produce una proteina che il corpo percepisce come estranea (come la GFP negli esperimenti), le cellule immunitarie possono eliminare tali cellule. Anche i veri geni umani possono a volte scatenare un'infiammazione di basso livello. Gli studi clinici sulla terapia genica retinica (ad esempio per RPE65) spesso prevedono la somministrazione di steroidi per attenuare questa risposta. Le vie che rimangono all'interno della retina (sottoretinica, sovracoroidale) tendono ad essere complessivamente meno immunogeniche rispetto alle iniezioni vitreali (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Le future terapie dovranno bilanciare una veicolazione efficiente con un'attivazione immunitaria minima, eventualmente utilizzando nuovi tipi di AAV o regimi immunosoppressivi.

Traslazione al Glaucoma

Il glaucoma presenta una sfida diversa rispetto a una lesione nervosa acuta. Nel glaucoma, le RGC muoiono lentamente a causa di fattori come l'alta pressione oculare, il ridotto flusso sanguigno e lo stress. Per trattare il glaucoma, la terapia genica deve funzionare in un contesto di lesione cronica. Ciò significa che la tempistica è importante: le terapie potrebbero dover essere somministrate precocemente per proteggere le RGC, o periodicamente per riadattare i segnali di crescita. Fortunatamente, alcuni lavori stanno iniziando a colmare questa lacuna. In uno studio recente, i ricercatori hanno utilizzato AAV per somministrare un recettore TrkB sempre attivo (F-iTrkB) negli occhi di topi modello di glaucoma. Questi topi hanno mostrato sia protezione delle RGC che una sostanziale rigenerazione assonale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ciò suggerisce che anche in condizioni glaucomatose, l'attivazione delle vie di crescita può essere d'aiuto.

Tuttavia, il passaggio dai modelli di schiacciamento al glaucoma umano richiederà ulteriori passaggi. Dobbiamo testare queste terapie geniche in modelli animali di glaucoma (come l'ipertensione oculare indotta o modelli genetici) piuttosto che solo in modelli di schiacciamento. Dobbiamo anche considerare l'invecchiamento e l'ambiente malato: neuroni più vecchi, tessuto cicatriziale e pressione oculare fluttuante. Sarà probabilmente necessario combinare la terapia genica con la cura standard del glaucoma (riduzione della pressione, utilizzo di fattori neurotrofici) e utilizzare sistemi genici controllati. Ad esempio, come notato, i costrutti AAV potrebbero utilizzare promotori inducibili in modo che il gene del fattore di crescita possa essere disattivato dopo la ricrescita degli assoni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Poiché il glaucoma umano progredisce lentamente, una singola iniezione genica potrebbe non essere sufficiente; potrebbero essere necessarie dosi ripetute o vettori a lunga durata d'azione. In sintesi, la traslazione di questi risultati alla terapia del glaucoma significherà adattarsi alle dinamiche della lesione cronica e garantire che i trattamenti siano sicuri e duraturi.

Conclusione

La terapia genica che modula le vie intrinseche delle RGC mostra un potenziale entusiasmante: nei roditori può far ricrescere il nervo ottico e persino ripristinare parte della vista. Strategie chiave come l'attivazione di PTEN/mTOR, la delezione di KLF4 o l'iperespressione di Sox11 conferiscono ciascuna stimoli rigenerativi attraverso diversi programmi cellulari. Studi sui topi confermano che gli assoni possono reinnervare il cervello e migliorare semplici compiti visivi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tuttavia, i problemi di sicurezza (rischio oncogenico, perdita cellulare, risposta immunitaria) devono essere risolti e i metodi di somministrazione affinati. I progressi nei vettori AAV e nelle iniezioni oculari forniscono strumenti per colpire efficacemente le RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I prossimi passi includono i test in modelli di glaucoma cronico, l'ottimizzazione del dosaggio e dei promotori e la combinazione della terapia genica con i trattamenti per il glaucoma. Nel complesso, le prove precliniche supportano fortemente ulteriori sviluppi: sintonizzando attentamente le vie di crescita intrinseche, potremmo cambiare radicalmente le prospettive per la riparazione del nervo ottico.