Giriş

Optik sinir yaralanması veya glokomdan kaynaklanan görme kaybı, retinal ganglion hücrelerinin (RGC'ler) aksonlarını yeniden büyütememesinden kaynaklanır. Yetişkin memelilerde, RGC'lerin intrinsik büyüme programı normalde kapalıdır, bu nedenle hasarlı sinirler kendiliğinden iyileşmez (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Son fare çalışmaları, gen terapisinin bu büyüme yollarını yeniden etkinleştirebileceğini göstermektedir. Örneğin, yetişkin RGC'lerde PTEN geninin (hücre büyümesini engelleyen bir fren) silinmesi, mTOR büyüme yolunu açar ve güçlü akson yenilenmesine yol açar (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bu makalede, PTEN/mTOR, KLF-ailesi genleri ve Sox11'in manipülasyonunun RGC akson yenilenmesini nasıl uyarabileceğini, bunun farelerde ne gibi başarılar sağladığını, güvenlik sorunlarını (kanser riski gibi), genlerin nasıl iletildiğini (AAV viral vektörler, intravitreal veya suprachoroidal enjeksiyon) ve akut yaralanma modellerinden kronik glokom tedavisine geçiş için atılması gereken adımları inceliyoruz.

RGC'lerde İntrinsik Büyüme Yolları

PTEN/mTOR Yolağı

Normal koşullar altında, yetişkin RGC'ler mTOR yolunu büyük ölçüde kapalı tutar, bu da yeni akson büyütme yeteneklerini sınırlar (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN, mTOR'u inhibe eden bir gendir. Bilim insanları, yetişkin fare RGC'lerinde PTEN'in çıkarılmasının mTOR sinyalini serbest bıraktığını ve akson yenilenmesine izin verdiğini bulmuşlardır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bir dönüm noktası niteliğindeki çalışmada, yetişkin farelerde PTEN'in koşullu gen nakavtı, güçlü optik sinir rejenerasyonuna yol açmıştır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hayatta kalan RGC'lerin yaklaşık %8-10'u aksonlarını yaralanmadan 0.5 mm'den fazla uzatmış, bazı aksonlar 3 mm'yi aşmış ve hatta yaralanmadan 4 hafta sonra optik kiazmaya ulaşmıştır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). mTOR üzerindeki başka bir fren olan TSC1 geninin nakavt edilmesi de akson yenilenmesini sağlamıştır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

PTEN'in silinmesi sadece yeniden büyümeyi teşvik etmekle kalmamış, aynı zamanda RGC sağkalımını da iyileştirmiştir (kontrollerde %20'ye karşılık yaklaşık %45 sağkalım) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ancak bir güvenlik endişesi vardır: PTEN bir tümör baskılayıcıdır. Uzun süreli PTEN kaybı, kontrolsüz hücre büyümesini teşvik edebilir. Gerçekten de, büyük bir rejenerasyon çalışması, kalıcı olarak PTEN'in silinmesinin kanser riski nedeniyle klinik olarak kabul edilemez olduğunu belirtmiştir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bunu ele almak için araştırmacılar, PTEN aktivitesinin yeniden büyüme sırasında kapatılıp daha sonra tekrar açılabilmesi için kontrol edilebilir gen terapisi (örneğin, değiştirilebilir bir promoter altında AAV ile verilen shRNA) kullanılmasını önermektedir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kısacası, PTEN/mTOR güçlü bir iç büyüme anahtarıdır, ancak dikkatlice kontrol edilmesi gerekir.

KLF Ailesi ve Sox11

Araştırmacılar, akson büyümesini kontrol eden transkripsiyon faktörlerini de hedeflemişlerdir. Krüppel benzeri faktörler (KLF'ler), bu tür genlerin bir ailesidir. Kilit bir bulgu, KLF4'ün akson büyümesini frenleyici rol oynamasıdır: KLF4'ten yoksun RGC'ler normalden daha iyi büyür (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). RGC'lerin KLF4'e sahip olmadığı farelerde, bu nöronlar kültürde çok daha uzun nöritler uzatmış ve optik sinir ezilmesinden sonra çok daha fazla akson büyümüştür. Örneğin, yaralanmadan iki hafta sonra, KLF4 nakavt fareleri, yabani tip farelere göre ezilme bölgesinden 1 mm ötede önemli ölçüde daha fazla yenilenen liflere sahipti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Diğer KLF'lerin çeşitli rolleri vardır: bazıları (KLF6 ve KLF7 gibi) büyümeyi teşvik ederken, diğerleri (KLF9 gibi) büyümeyi baskılar (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dolayısıyla, KLF ifadesinin yeniden dengelenmesi, RGC büyümesi üzerindeki bazı gelişimsel “frenleri” kaldırabilir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Gelişimde önemli olan başka bir transkripsiyon faktörü Sox11'dir. Yetişkin RGC'lerde Sox11'in aşırı ifadesi (AAV gen teslimi kullanılarak) de rejenerasyonu artırdığı bulunmuştur. Bir çalışmada, ekstra Sox11'e sahip RGC'ler, yaralanma sonrası akson yenilenmesinde belirgin bir artış gösterdi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ancak, Sox11'in karışık etkileri vardır: belirli RGC tiplerinde yenilenmeyi teşvik ederken, diğerlerini öldürebilir. Özellikle, Sox11 aşırı ifadesi, genellikle PTEN tabanlı tedavilere iyi yanıt veren sözde “alfa” RGC'lerin (bir RGC alt tipi) neredeyse tamamını öldürmüştür (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Başka bir deyişle, Sox11 bazı RGC'leri büyüme yeteneğine sahip bir duruma yeniden programlarken, diğerlerine de zarar verir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bilim insanları, farklı RGC alt tiplerinin farklı yeniden büyüme stratejileri gerektirdiği sonucuna varmışlardır.

Önemli Fare Optik Sinir Ezme Çalışmaları

Fare optik sinir yaralanması modelleri (optik sinir ezmesi), bu gen manipülasyonlarının pratikte nasıl çalıştığını göstermiştir. Maksimum etki için klasik bir yaklaşım, yolların birleştirilmesini içeriyordu. Bir PNAS çalışmasında, bilim insanları üç tedavi uyguladı: PTEN'i silme, gözde inflamasyon indüksiyonu (zymosan) ve cAMP'yi yükseltme. Bu üçlü, RGC'lerin aksonlarını optik sinir boyunca ve beynin görsel merkezlerine kadar yeniden büyümesini tetikledi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tedavi edilen farelerin beyinlerini incelediklerinde, birçok yenilenen lifin lateral genikulat çekirdeğe, superior kollikulusa ve diğer görsel bölgelere ulaştığını gördüler (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Önemlisi, bu yeniden büyüme, görselle ilgili davranışların kısmi olarak düzelmesine yol açtı. Tedavi edilen fareler, basit görsel görevleri yerine getirme yeteneğinin bir kısmını geri kazandılar: hareketli desenleri takip edebildiler (bir optomotor refleks) ve yaralı kontrollere göre derinliği daha iyi değerlendirebildiler (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Hatta daha iyi sirkadiyen ışık tepkileri gösterdiler [20†L33-L38], ancak bu detaylar ölçülmesi zor olabilir.) Bu çalışma, yetişkin farelerde uzun mesafeli akson yenilenmesinin görsel sistemin bölümlerini işlevsel olarak yeniden bağlayabileceğini gösterdi.

Diğer çalışmalar bireysel faktörlere odaklandı. İntravitreal yolla sürekli aktif TrkB (beyin kaynaklı bir nörotrofik faktör reseptörü) taşıyan bir AAV verilmesi daha da uzun büyümeye neden oldu. Örneğin, Nishijima ve ark. AAV ile verilen tasarlanmış bir TrkB (F-iTrkB olarak adlandırılır) kullandılar ve aksonların 4.5 mm'den fazla yeniden büyüdüğünü, bazılarının optik kiazmaya ulaştığını gördüler (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Benzer şekilde, aktif K-Ras (iyi bilinen bir onkogen) gibi büyümeyi teşvik eden bir geni RGC'lere zorla sokmak yaklaşık 3 mm rejenerasyon sağladı (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). İlginç bir şekilde, tedavi edilen gözlerde tümör görülmedi, ancak yazarlar güvenlik için yine de indüklenebilir açma/kapama gen anahtarları kullanılmasını önermektedir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bu ve diğer çalışmalar, intrinsik büyüme genlerinin açılmasının fare optik sinir yaralanması modellerinde rejenerasyonu gerçekten tetikleyebileceğini doğrulamaktadır.

Kısmi Görme Kurtarımı

Fare deneyleri genellikle sadece anatomiyi değil, işlevi de izledi. Optomotor refleks (farelerin hareketli şeritleri takip etmesi) ve derinlik algısı testleri, görmenin iyileşip iyileşmediğini görmenin basit yollarıdır. Üçlü tedavi çalışmasında (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), fareler bu reflekslerin kısmi olarak geri kazanıldığını gösterdi. Tekrar hareketli görsellere tepki verebildiler ve derinliği değerlendirebildiler, oysa tedavi görmeyen yaralı fareler bunu yapamadı (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bu cesaret verici: yeniden büyüyen aksonların faydalı bağlantılar kurduğu anlamına geliyor. Ancak, iyileşme sadece kısmiydi. Birçok görsel yol (özellikle ince görüntü oluşturan görme) bağlantısız kalmaya devam ediyor. Şimdiye kadar, rejenerasyon temel görsel tepkileri geri getirmiştir, ancak tam görmeyi değil. Yine de, herhangi bir işlevsel kazanç görmek, bu stratejilerin potansiyelini doğrulamaktadır.

Güvenlik Hususları

Rejenerasyon için gen terapisi umut vaat etse de, güvenlik kritik bir konudur. Aksonlara yardımcı olan aynı büyüme yolları, kontrol edilmezse sorunlara da neden olabilir. Belirtildiği gibi, PTEN'in kalıcı olarak silinmesi bir kanser riskidir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Benzer şekilde, mTOR'u kronik olarak aktive etmek tümör büyümesine yol açabilir (örneğin, TSC1/2 hastalarında tümörler oluşur). Büyüme faktörlerini (mühendislik ürünü RAS veya diğer onkogenler gibi) zorlayan gen terapileri dikkatle kontrol edilmelidir. Özellikle, deneysel AAV-RAS terapisinde fare gözlerinde tümör gözlenmedi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ancak yazarlar, herhangi bir onkojenik aktivitenin kapatılması gerekmesi durumunda düzenlenmiş (indüklenebilir) sistemler kullanılmasını vurgulamaktadır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Diğer güvenlik sorunları arasında hücre ölümü ve bağışıklık reaksiyonları yer alır. Bazı müdahaleler belirli hücrelere zarar verir: örneğin, Sox11 aşırı ifadesi birçok alfa-tipi RGC'yi öldürmüştür (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). RGC'leri öldüren herhangi bir terapi faydasını ortadan kaldırır. Enjeksiyonlardan veya iltihaplanmadan kaynaklanan hasar riski de vardır. Enflamasyonu indüklemek (zymosan) farelerde rejenerasyona yardımcı oldu, ancak insanlarda tehlikeli olacaktır. AAV eklemelerinin uzun vadeli etkileri (eklemeli mutagenez gibi) düşüktür, ancak herhangi bir oküler gen terapisi dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Kısacası, her büyüme destekleyici genin potansiyel zarar ile dengelenmesi gerekir: ideal olarak geçici olarak veya sıkı kontrol altında iletilmelidir.

Gen Teslim Stratejileri

Genleri doğru hücrelere ulaştırmak önemli bir zorluktur. RGC'ler için, adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler) temel vektörlerdir. AAV'ler, retinal hücrelere terapötik genleri taşıyabilen güvenli, kendini kopyalamayan virüslerdir. Yaygın bir yöntem, intravitreal enjeksiyon'dur: AAV'nin doğrudan gözün vitreus jeline enjekte edilmesi. AAV2, retinal transdüksiyon için klasik serotiptir; intravitreal olarak enjekte edildiğinde RGC'lere verimli bir şekilde ulaşır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nitekim, bir çalışma intravitreal AAV2'nin RGC'lerin %90'ından fazlasını transdükte ettiğini bulmuştur (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Başka kapsidler de kullanılabilir. Örneğin, intravitreal olarak verilen AAV6, iç retina ve RGC katmanı için çok yüksek tropizme sahiptir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bilim insanları ayrıca retinal bariyerleri daha da iyi aşmak için AAV2 varyantlarını (mutasyonlar veya kimerler gibi) tasarlamaktadır, ancak bu detaylar gelişmektedir.

Diğer bir yol ise suprachoroidal enjeksiyon'dur; burada bir iğne veya mikrokanül, AAV'yi sklera ile koroid (vasküler tabaka) arasına verir. Bu yaklaşım, vektörü retina altına geniş bir şekilde yayar. Maymunlarda suprachoroidal AAV8, geniş gen ifadesi ile sonuçlanmıştır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Özel olarak tasarlanmış mikroiğnelerle yapılabilir. Suprachoroidal teslimat büyük ameliyatı önler, ancak yine de invazivdir ve lokal inflamasyona neden olabilir. Aslında, suprachoroidal AAV8, steroid gerektiren hafif koriyoretinite (koroid iltihabı) neden oldu, ancak haftalar içinde düzeldi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Önemlisi, suprachoroidal teslimat, intravitreal teslimattan daha zayıf sistemik antikor yanıtları tetikledi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bunun nedeni muhtemelen bazı virüsün gözden farklı şekilde kaçmasıdır. Genel olarak, suprachoroidal enjeksiyon, gözün arkasına gen terapisi için umut vaat etmektedir, ancak immün etkilerinin yönetilmesi gerekir.

İmmünojenisite

Gözün bir dereceye kadar “bağışıklık açısından ayrıcalıklı” olmasına rağmen, AAV gen teslimi yine de bağışıklık reaksiyonlarını provoke edebilir. İntravitreal AAV genellikle drenaj kanalları yoluyla gözden sızar. Primatlarda yapılan bir çalışma, intravitreal AAV'nin kan dolaşımında subretinal enjeksiyona kıyasla ~400–500 kat daha fazla virüsle sonuçlandığını bulmuştur (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bu, AAV kapsidine karşı çok güçlü bir antikor yanıtına neden oldu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Aksine, subretinal AAV (retina altına enjekte edilen), gözde sekestrasyon gösterir ve tipik olarak neredeyse hiç anti-kapsid antikoru üretmez (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprachoroidal AAV ise arada bir yerdedir: bazı virüs gözde kalırken bazıları yakındaki dokulara ulaşır. Çalışmalar, suprachoroidal AAV'nin intravitrealden daha hafif anti-kapsid antikor üretimine neden olduğunu göstermektedir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ancak kan-retina bariyeri dışındaki hücreleri transdükte ettiği için gen ürününe (GFP'de görüldüğü gibi) karşı bağışıklık hücrelerini uyarabilir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Antikorlara ek olarak, T-hücre yanıtları transdükte hücrelere saldırabilir. Eğer yerleştirilen gen, vücudun yabancı olarak gördüğü bir protein (deneylerdeki GFP gibi) üretirse, bağışıklık hücreleri bu hücreleri temizleyebilir. Gerçek insan genleri bile bazen düşük seviyeli inflamasyonu tetikleyebilir. Klinik retinal gen denemeleri (örneğin RPE65 için) bu yanıtı bastırmak için genellikle steroid verir. Retina içinde kalan yollar (subretinal, suprachoroidal) genel olarak vitreus enjeksiyonlarından daha az immünojenik olma eğilimindedir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Gelecekteki tedaviler, muhtemelen daha yeni AAV tipleri veya immün-baskılayıcı rejimler kullanarak verimli teslimat ile minimum immün aktivasyonu dengelemek zorunda kalacaktır.

Glokoma Aktarım

Glokom, akut bir sinir ezmesinden farklı bir zorluk sunar. Glokomda, RGC'ler yüksek göz basıncı, azalan kan akışı ve stres gibi faktörler nedeniyle yavaşça ölür. Glokomu tedavi etmek için gen terapisinin kronik bir yaralanma ortamında çalışması gerekir. Bu, zamanlamanın önemli olduğu anlamına gelir: tedavilerin RGC'leri korumak için erken verilmesi veya büyüme sinyallerini yeniden ayarlamak için periyodik olarak verilmesi gerekebilir. Neyse ki, bu boşluğu kapatmaya yönelik bazı çalışmalar başlamıştır. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, araştırmacılar glokom modeli farelerin gözlerine her zaman açık bir TrkB reseptörü (F-iTrkB) iletmek için AAV kullandılar. Bu fareler hem RGC'lerin korunmasını hem de önemli akson yenilenmesini gösterdi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bu, glokomatöz koşullarda bile büyüme yollarının aktive edilmesinin yardımcı olabileceğini düşündürmektedir.

Yine de, ezme modellerinden insan glokomuna geçiş daha fazla adım gerektirecektir. Bu gen terapilerini sadece ezme modellerinde değil, hayvan glokom modellerinde (indüklenmiş oküler hipertansiyon veya genetik modeller gibi) test etmemiz gerekiyor. Ayrıca yaşlanmayı ve hastalıklı ortamı da göz önünde bulundurmalıyız: yaşlı nöronlar, yara dokusu ve dalgalanan göz basıncı. Gen terapisini standart glokom bakımı (basıncı düşürme, nörotrofik faktörler kullanma) ile birleştirmek ve kontrollü gen sistemleri kullanmak muhtemelen gerekli olacaktır. Örneğin, belirtildiği gibi, AAV yapıları indüklenebilir promoterler kullanabilir, böylece aksonlar yeniden büyüdükten sonra büyüme faktörü geni kapatılabilir (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). İnsan glokomu yavaş ilerlediği için, tek bir gen enjeksiyonu yeterli olmayabilir; tekrarlanan dozlama veya uzun süreli vektörler gerekebilir. Özetle, bu bulguları glokom tedavisine aktarmak, kronik yaralanma dinamiklerine uyum sağlamayı ve tedavilerin güvenli ve kalıcı olmasını sağlamayı gerektirecektir.

Sonuç

RGC intrinsik yollarını modüle eden gen terapisi heyecan verici bir potansiyel göstermektedir: kemirgenlerde optik sinirin yeniden büyümesini ve hatta bir miktar görmeyi geri getirebilir. PTEN/mTOR aktivasyonu, KLF4 silinmesi veya Sox11 aşırı ifadesi gibi temel stratejiler, farklı hücre programları aracılığıyla rejeneratif güçlendirmeler sağlar. Fare çalışmaları, aksonların beyni yeniden inerve edebileceğini ve basit görsel görevleri iyileştirebileceğini doğrulamaktadır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ancak, güvenlik sorunları (onkojenik risk, hücre kaybı, immün yanıt) çözülmeli ve teslimat yöntemleri geliştirilmelidir. AAV vektörleri ve oküler enjeksiyonlardaki ilerlemeler, RGC'leri verimli bir şekilde hedeflemek için araçlar sağlamaktadır (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sonraki adımlar arasında kronik glokom modellerinde test etme, dozaj ve promoterleri optimize etme ve gen terapisini glokom tedavileriyle birleştirme yer almaktadır. Genel olarak, preklinik kanıtlar daha fazla geliştirmeyi güçlü bir şekilde desteklemektedir: intrinsik büyüme yollarını dikkatlice ayarlayarak, optik sinir onarımı için görünümü temelden değiştirebiliriz.