Introducere

Pierderea vederii cauzată de leziuni ale nervului optic sau glaucom apare deoarece celulele ganglionare retiniene (CGR) nu reușesc să-și regenereze axonii. La mamiferele adulte, programul de creștere intrinsecă al CGR este în mod normal oprit, astfel încât nervii deteriorați nu se vindecă de la sine (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Studii recente pe șoareci arată că terapia genetică poate reactiva aceste căi de creștere. De exemplu, ștergerea genei PTEN (o frână a creșterii celulare) în CGR adulte activează calea de creștere mTOR și duce la o regenerare puternică a axonilor (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). În acest articol, analizăm modul în care manipularea PTEN/mTOR, a genelor din familia KLF și a Sox11 poate stimula regenerarea axonilor CGR, ce s-a realizat prin aceasta la șoareci, problemele de siguranță (cum ar fi riscul de cancer), modul de livrare a genelor (vectori virali AAV, injecție intravitreală sau supracoroidală) și pașii necesari pentru a trece de la modelele de leziuni acute la tratamentul glaucomului cronic.

Căile de Creștere Intrinseci în CGR

Calea PTEN/mTOR

În condiții normale, CGR adulte mențin calea mTOR în mare parte oprită, ceea ce le limitează capacitatea de a crește noi axoni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN este o genă care inhibă mTOR. Oamenii de știință au descoperit că eliminarea PTEN în CGR de șoarece adulte declanșează semnalizarea mTOR și permite regenerarea axonilor (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Într-un studiu de referință, knockout-ul condiționat al PTEN la șoareci adulți a dus la o regenerare robustă a nervului optic (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Aproximativ 8–10% dintre CGR supraviețuitoare au extins axonii cu mai mult de 0,5 mm dincolo de leziune, iar unii axoni au crescut peste 3 mm și chiar au ajuns la chiasma optică la 4 săptămâni după leziune (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eliminarea unei alte frâne a mTOR, gena TSC1, a indus, de asemenea, regenerarea axonilor (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Ștergerea PTEN nu numai că a stimulat regenerarea, dar a și îmbunătățit supraviețuirea CGR (aproximativ 45% supraviețuire față de ~20% la controale) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cu toate acestea, există o preocupare legată de siguranță: PTEN este un supresor tumoral. Pierderea pe termen lung a PTEN poate promova creșterea celulară necontrolată. Într-adevăr, un studiu major de regenerare a menționat că ștergerea permanentă a PTEN ar fi inacceptabilă clinic din cauza riscului de cancer (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pentru a aborda această problemă, cercetătorii sugerează utilizarea terapiei genice controlabile (de exemplu, shRNA livrat prin AAV sub un promotor comutabil), astfel încât activitatea PTEN să poată fi oprită în timpul regenerării și apoi repornită (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pe scurt, PTEN/mTOR este un comutator intern puternic de creștere, dar trebuie controlat cu atenție.

Familia KLF și Sox11

Cercetătorii au vizat și factori de transcripție care controlează creșterea axonilor. Factorii asemănători Krüppel (KLF) sunt o familie de astfel de gene. O descoperire cheie este că KLF4 acționează ca o frână a creșterii axonilor: CGR-urile cărora le lipsește KLF4 cresc mai bine decât cele normale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). La șoareci modificați genetic astfel încât CGR-urile să nu aibă KLF4, acești neuroni au extins neurite mult mai lungi în cultură și, după strivirea nervului optic, mult mai mulți axoni au crescut. De exemplu, la două săptămâni după leziune, șoarecii cu knockout de KLF4 aveau semnificativ mai multe fibre regeneratoare dincolo de 1 mm de la locul strivirii decât șoarecii de tip sălbatic (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Alți KLF au roluri variate: unii (cum ar fi KLF6 și KLF7) promovează creșterea, în timp ce alții (cum ar fi KLF9) o suprimă (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Astfel, reechilibrarea expresiei KLF poate ridica unele dintre „frânele” de dezvoltare ale creșterii CGR (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Un alt factor de transcripție este Sox11, important în dezvoltare. Supraexpresia Sox11 în CGR adulte (folosind livrarea genică prin AAV) s-a dovedit, de asemenea, că stimulează regenerarea. Într-un studiu, CGR cu Sox11 suplimentar au prezentat o creștere marcată a regenerării axonilor după leziune (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cu toate acestea, Sox11 are efecte mixte: promovează regenerarea la anumite tipuri de CGR, dar le poate ucide pe altele. În special, supraexpresia Sox11 a ucis aproape toate CGR-urile așa-numite „alfa” (un subtip de CGR) care de obicei răspund bine la tratamentele bazate pe PTEN (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cu alte cuvinte, Sox11 reprogramează unele CGR-uri într-o stare competentă de creștere, dar le dăunează și altora (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Oamenii de știință concluzionează că diferite subtipuri de CGR necesită strategii diferite de regenerare.

Studii Cheie pe Șoareci privind Strivirea Nervului Optic

Modelele de leziuni ale nervului optic la șoareci (strivirea nervului optic) au arătat cum funcționează în practică aceste manipulări genetice. O abordare clasică a combinat căi pentru un efect maxim. Într-un studiu PNAS, oamenii de știință au aplicat trei tratamente: ștergerea PTEN, inducerea inflamației în ochi (zimosan) și creșterea cAMP. Acest trio a declanșat regenerarea axonilor CGR până la capătul nervului optic și în centrele vizuale ale creierului (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Când au examinat creierul șoarecilor tratați, multe fibre regeneratoare au ajuns la nucleul geniculat lateral, coliculul superior și alte zone vizuale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Important este că această regenerare a dus la o recuperare parțială a comportamentelor legate de vedere. Șoarecii tratați au recâștigat o parte din capacitatea de a efectua sarcini vizuale simple: puteau urmări tipare în mișcare (un reflex optomotor) și judeca adâncimea mai bine decât controalele rănite (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Au arătat chiar și răspunsuri circadiene mai bune la lumină [20†L33-L38], deși aceste detalii pot fi greu de măsurat.) Această lucrare a demonstrat că regenerarea axonilor pe distanțe lungi la șoarecii adulți poate reconecta funcțional părți ale sistemului vizual.

Alte studii s-au concentrat pe factori individuali. Livrarea intravitreală a unui AAV care transporta un TrkB constitutiv activ (un receptor al factorului neurotrofic derivat din creier) a cauzat o creștere chiar mai lungă. De exemplu, Nishijima et al. au utilizat un TrkB modificat (numit F-iTrkB) livrat prin AAV și au observat axonii regenerându-se peste 4,5 mm, unii ajungând la chiasma optică (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Similar, forțarea unei gene care promovează creșterea, cum ar fi K-Ras activ (o oncogenă bine-cunoscută), în CGR a produs aproximativ 3 mm de regenerare (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Interesant este că nu au fost observate tumori în ochii tratați, dar autorii recomandă totuși utilizarea comutatoarelor genice inductibile on/off pentru siguranță (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Aceste studii și altele confirmă că activarea genelor de creștere intrinsecă poate într-adevăr determina regenerarea în modelele de leziuni ale nervului optic la șoareci.

Recuperare Vizuală Parțială

Experimentele pe șoareci au urmărit nu doar anatomia, ci și funcția. Reflexul optomotor (șoareci care urmăresc dungi în mișcare) și testele de percepție a adâncimii sunt moduri simple de a vedea dacă vederea se îmbunătățește. În studiul cu tratament triplu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), șoarecii au arătat o restaurare parțială a acestor reflexe. Ei puteau din nou să răspundă la stimuli vizuali în mișcare și să judece adâncimea, în timp ce șoarecii răniți fără tratament nu puteau (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Acest lucru este încurajator: înseamnă că axonii regenerați au făcut conexiuni utile. Cu toate acestea, recuperarea a fost doar parțială. Multe căi vizuale (în special vederea fină, de formare a imaginilor) rămân deconectate. Până în prezent, regenerarea a restaurat răspunsuri vizuale de bază, dar nu și vederea completă. Totuși, observarea oricărui câștig funcțional confirmă potențialul acestor strategii.

Considerații de Siguranță

Deși terapia genică pentru regenerare este promițătoare, siguranța este o preocupare critică. Aceleași căi de creștere care ajută axonii pot provoca, de asemenea, probleme dacă sunt lăsate necontrolate. Așa cum s-a menționat, ștergerea permanentă a PTEN prezintă un risc de cancer (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). La fel, activarea cronică a mTOR poate duce la creșterea tumorilor (de exemplu, pacienții cu TSC1/2 dezvoltă tumori). Terapiile genice care stimulează factorii de creștere (cum ar fi RAS modificat sau alte oncogene) trebuie controlate cu atenție. De remarcat este că, în terapia experimentală AAV-RAS, nu au fost observate tumori în ochii șoarecilor (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), dar autorii subliniază utilizarea sistemelor reglate (inductibile) în cazul în care orice activitate oncogenă trebuie oprită (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Alte probleme de siguranță includ moartea celulară și reacțiile imune. Unele intervenții dăunează anumitor celule: de exemplu, supraexpresia Sox11 a ucis multe CGR de tip alfa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Orice terapie care ucide CGR-urile anulează beneficiul său. Există, de asemenea, riscul de deteriorare din cauza injecțiilor sau inflamației. Inducerea inflamației (zimosan) a ajutat regenerarea la șoareci, dar la oameni ar fi periculoasă. Efectele pe termen lung ale inserțiilor AAV (cum ar fi mutageneza inserțională) sunt scăzute, dar orice terapie genică oculară necesită o evaluare atentă. Pe scurt, fiecare genă care promovează creșterea trebuie echilibrată cu potențialul de a provoca daune: ideal, livrată tranzitoriu sau sub un control strict.

Strategii de Livrare a Genelor

Introducerea genelor în celulele corecte este o provocare cheie. Pentru CGR, virusurile adeno-asociate (AAV) sunt vectorii de bază. AAV-urile sunt virusuri sigure, nereplicatoare, care pot transporta gene terapeutice în celulele retiniene. O metodă comună este injecția intravitreală: injectarea AAV direct în gelul vitros al ochiului. AAV2 este serotipul clasic pentru transducția retiniană; ajunge eficient la CGR atunci când este injectat intravitreal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). De fapt, un studiu a constatat că AAV2 intravitreal a transdus peste 90% din CGR (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pot fi utilizate și alte capside. De exemplu, AAV6 administrat intravitreal prezintă un tropism foarte ridicat pentru retina internă și stratul CGR (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Oamenii de știință, de asemenea, inginerizează variante de AAV2 (cum ar fi mutații sau himere) pentru a traversa barierele retiniene și mai bine, dar aceste detalii sunt în evoluție.

O altă cale este injecția supracoroidală, unde un ac sau o microcanulă livrează AAV între scleră și coroidă (stratul vascular). Această abordare răspândește vectorul pe scară largă sub retină. AAV8 supracoroidal la maimuțe a dus la o expresie genică largă (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Acest lucru se poate realiza cu microace special concepute. Livrarea supracoroidală evită intervenția chirurgicală majoră, dar este încă invazivă și poate provoca inflamație locală. De fapt, AAV8 supracoroidal a cauzat o corioretinită ușoară (inflamație a coroidei) care a necesitat steroizi, deși s-a rezolvat în câteva săptămâni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Important este că livrarea supracoroidală a declanșat răspunsuri sistemice de anticorpi mai slabe la capsida AAV decât livrarea intravitreală (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Acest lucru se datorează probabil faptului că o parte din virus scapă din ochi în mod diferit. În general, injecția supracoroidală este promițătoare pentru terapia genică în partea posterioară a ochiului, dar efectele sale imune necesită gestionare.

Imunogenitatea

Deși ochiul este într-o oarecare măsură „imunoprivilegiat”, livrarea genică prin AAV poate totuși provoca reacții imune. AAV-ul intravitreal se scurge adesea din ochi prin canalele de drenaj. Un studiu pe primate a constatat că AAV-ul intravitreal a dus la o cantitate de virus în sânge de aproximativ 400–500 de ori mai mare comparativ cu injecția subretiniană (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Acest lucru a cauzat un răspuns anticorp foarte puternic împotriva capsidei AAV (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). În contrast, AAV-ul subretinian (injectat sub retină) este sechestrat în ochi și, de obicei, nu provoacă aproape deloc anticorpi anti-capsidă (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). AAV-ul supracoroidal se situează între cele două: o parte din virus rămâne în ochi, în timp ce o parte ajunge în țesuturile învecinate. Studiile arată că AAV-ul supracoroidal provoacă o producție de anticorpi anti-capsidă mai blândă decât cel intravitreal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), dar poate stimula celulele imune împotriva produsului genic (așa cum s-a observat cu GFP), deoarece transudă celulele din afara barierei hemato-retiniene (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Pe lângă anticorpi, răspunsurile celulelor T pot ataca celulele transdusede. Dacă gena inserată produce o proteină pe care organismul o consideră străină (cum ar fi GFP în experimente), celulele imune pot elimina acele celule. Chiar și genele umane reale pot declanșa uneori inflamații de nivel scăzut. Studiile clinice de terapie genică retiniană (de exemplu, pentru RPE65) administrează adesea steroizi pentru a atenua acest răspuns. Căile care rămân în interiorul retinei (subretiniană, supracoroidală) tind să fie mai puțin imunogene în general decât injecțiile vitreale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Terapiile viitoare vor trebui să echilibreze livrarea eficientă cu activarea imună minimă, posibil folosind noi tipuri de AAV sau regimuri imuno-supresoare.

Transpunerea la Glaucom

Glaucomul prezintă o provocare diferită față de o strivire acută a nervului. În glaucom, CGR-urile mor lent din cauza unor factori precum presiunea oculară ridicată, fluxul sanguin redus și stresul. Pentru a trata glaucomul, terapia genică trebuie să funcționeze într-un context de leziune cronică. Aceasta înseamnă că momentul este important: terapiile ar putea fi necesare să fie administrate devreme pentru a proteja CGR-urile sau periodic pentru a reajusta semnalele de creștere. Din fericire, unele lucrări încep să reducă această discrepanță. Într-un studiu recent, cercetătorii au folosit AAV pentru a livra un receptor TrkB activ permanent (F-iTrkB) în ochii șoarecilor model de glaucom. Acești șoareci au prezentat atât protecția CGR-urilor, cât și o regenerare substanțială a axonilor (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Acest lucru sugerează că, chiar și în condiții glaucomatoase, activarea căilor de creștere poate ajuta.

Totuși, trecerea de la modelele de strivire la glaucomul uman va necesita mai mulți pași. Trebuie să testăm aceste terapii genice în modele animale de glaucom (cum ar fi hipertensiunea oculară indusă sau modele genetice), nu doar în cele de strivire. De asemenea, trebuie să luăm în considerare îmbătrânirea și mediul bolnav: neuroni mai în vârstă, țesut cicatricial și presiune oculară fluctuantă. Va fi probabil necesar să combinăm terapia genică cu îngrijirea standard a glaucomului (scăderea presiunii, utilizarea factorilor neurotrofici) și să utilizăm sisteme genice controlate. De exemplu, așa cum s-a menționat, constructele AAV ar putea folosi promotori inductibili, astfel încât gena factorului de creștere să poată fi oprită după regenerarea axonilor (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Deoarece glaucomul uman progresează lent, o singură injecție genică ar putea să nu fie suficientă; ar putea fi necesare doze repetate sau vectori cu acțiune îndelungată. Pe scurt, transpunerea acestor descoperiri în terapia glaucomului va însemna ajustarea pentru dinamica leziunilor cronice și asigurarea că tratamentele sunt sigure și durabile.

Concluzie

Terapia genică care modulează căile intrinseci ale CGR prezintă un potențial incitant: la rozătoare poate face nervul optic să se regenereze și chiar să restabilească o parte din vedere. Strategii cheie precum activarea PTEN/mTOR, ștergerea KLF4 sau supraexpresia Sox11 oferă fiecare stimulente regenerative prin programe celulare diferite. Studiile pe șoareci confirmă că axonii pot reinerva creierul și pot îmbunătăți sarcini vizuale simple (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cu toate acestea, problemele de siguranță (risc oncogen, pierdere celulară, răspuns imun) trebuie rezolvate, iar metodele de livrare rafinate. Progresele în vectorii AAV și injecțiile oculare oferă instrumente pentru a viza CGR-urile eficient (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Următorii pași includ testarea în modele de glaucom cronic, optimizarea dozării și a promotorilor și combinarea terapiei genice cu tratamentele pentru glaucom. În ansamblu, dovezile preclinice susțin puternic dezvoltarea ulterioară: prin reglarea atentă a căilor de creștere intrinsecă, putem schimba fundamental perspectivele pentru repararea nervului optic.