Introductie

Verlies van het gezichtsvermogen door beschadiging van de oogzenuw of glaucoom ontstaat doordat retinale ganglioncellen (RGC's) hun axonen niet opnieuw laten groeien. Bij volwassen zoogdieren wordt het intrinsieke groeiprogramma van RGC's normaal gesproken uitgeschakeld, waardoor beschadigde zenuwen niet vanzelf genezen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Recent muizenonderzoek toont aan dat gentherapie deze groeitrajecten kan reactiveren. Zo leidt het verwijderen van het PTEN-gen (een rem op celgroei) in volwassen RGC's tot activering van het mTOR-groeitraject en een sterke hergroei van axonen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). In dit artikel bespreken we hoe manipulatie van PTEN/mTOR, KLF-familiegenen en Sox11 RGC-axonregeneratie kan stimuleren, wat dit heeft bereikt bij muizen, de veiligheidskwesties (zoals kankerrisico), hoe genen worden afgeleverd (AAV virale vectoren, intravitreale of suprachoroïdale injectie), en welke stappen nodig zijn om van acute letselmodellen naar chronische glaucoombehandeling te gaan.

Intrinsieke Groeitrajecten in RGC's

PTEN/mTOR Traject

Onder normale omstandigheden houden volwassen RGC's het mTOR-traject grotendeels uitgeschakeld, wat hun vermogen om nieuwe axonen te laten groeien beperkt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN is een gen dat mTOR remt. Wetenschappers ontdekten dat het verwijderen van PTEN in volwassen muis-RGC's de mTOR-signalering ontketent en axonhergroei mogelijk maakt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). In één baanbrekend onderzoek leidde conditionele uitschakeling van PTEN bij volwassen muizen tot robuuste regeneratie van de oogzenuw (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ongeveer 8–10% van de overlevende RGC's verlengde axonen meer dan 0,5 mm voorbij de laesie, waarbij sommige axonen meer dan 3 mm groeiden en zelfs het optisch chiasma bereikten binnen 4 weken na de blessure (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Het uitschakelen van een andere rem op mTOR, het TSC1-gen, induceerde ook axonhergroei (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Het verwijderen van PTEN stimuleerde niet alleen hergroei, maar verbeterde ook de overleving van RGC's (ongeveer 45% overleving versus ~20% in controles) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Er is echter een veiligheidsbezwaar: PTEN is een tumorsuppressorgen. Langdurig verlies van PTEN kan ongecontroleerde celgroei bevorderen. Sterker nog, een belangrijk regeneratiestudie merkte op dat het permanent verwijderen van PTEN klinisch onaanvaardbaar zou zijn vanwege het kankerrisico (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Om dit aan te pakken, stellen onderzoekers voor om controleerbare gentherapie te gebruiken (bijvoorbeeld AAV-geleverd shRNA onder een schakelbare promotor), zodat de PTEN-activiteit tijdens de hergroei kan worden uitgeschakeld en vervolgens weer ingeschakeld (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kortom, PTEN/mTOR is een krachtige interne groeischakelaar, maar deze moet zorgvuldig worden gecontroleerd.

KLF Familie en Sox11

Onderzoekers hebben zich ook gericht op transcriptiefactoren die de axongroei controleren. De Krüppel-achtige factoren (KLF's) zijn een familie van dergelijke genen. Een belangrijke bevinding is dat KLF4 fungeert als een rem op axongroei: RGC's die KLF4 missen, groeien beter dan normaal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bij muizen die zo waren gemanipuleerd dat RGC's geen KLF4 hadden, verlengden deze neuronen veel langere neurieten in cultuur en, na oogzenuwcompressie, groeiden veel meer axonen uit. Twee weken na de blessure hadden KLF4-knock-out muizen bijvoorbeeld significant meer regenererende vezels voorbij 1 mm van de compressieplaats dan wildtype muizen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andere KLF's hebben verschillende rollen: sommige (zoals KLF6 en KLF7) bevorderen groei, terwijl andere (zoals KLF9) deze onderdrukken (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Het herstellen van de KLF-expressie kan dus enkele van de ontwikkelingsgerelateerde “remmen” op RGC-groei opheffen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Een andere transcriptiefactor is Sox11, belangrijk in de ontwikkeling. Overexpressie van Sox11 in volwassen RGC's (met behulp van AAV-gentherapie) bleek ook de regeneratie te stimuleren. In één studie toonden RGC's met extra Sox11 een aanzienlijke toename in axonhergroei na letsel (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sox11 heeft echter gemengde effecten: het bevordert hergroei in bepaalde RGC-types, maar kan andere doden. Met name doodde Sox11-overexpressie bijna alle zogenaamde “alfa”-RGC's (een subtype van RGC) die gewoonlijk goed reageren op PTEN-gebaseerde behandelingen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Met andere woorden, Sox11 herprogrammeert sommige RGC's naar een groeicompetente staat, maar schaadt ook andere (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wetenschappers concluderen dat verschillende RGC-subtypen verschillende hergroeistrategieën vereisen.

Belangrijke Muizenstudies naar Oogzenuwcompressie

Muizenmodellen van oogzenuwletsel (oogzenuwcompressie) hebben laten zien hoe deze genmanipulaties in de praktijk werken. Een klassieke benadering combineerde trajecten voor maximaal effect. In één PNAS-studie pasten wetenschappers drie behandelingen toe: het verwijderen van PTEN, het induceren van ontsteking in het oog (zymosan) en het verhogen van cAMP. Dit trio zorgde ervoor dat RGC's axonen helemaal door de oogzenuw en in de visuele centra van de hersenen lieten teruggroeien (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Toen ze de hersenen van behandelde muizen onderzochten, bereikten veel regenererende vezels de laterale geniculate nucleus, de superior colliculus en andere visuele gebieden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Belangrijk is dat deze hergroei leidde tot gedeeltelijk herstel van gezichtsgerelateerd gedrag. Behandelde muizen kregen enig vermogen terug om eenvoudige visuele taken uit te voeren: ze konden bewegende patronen volgen (een optomotorische reflex) en diepte beter inschatten dan gewonde controles (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Ze vertoonden zelfs betere circadiane lichtresponsen [20†L33-L38], hoewel die details moeilijk te meten kunnen zijn.) Dit werk toonde aan dat lange-afstandsaxonregeneratie bij volwassen muizen delen van het visuele systeem functioneel opnieuw kan verbinden.

Andere studies richtten zich op individuele factoren. Intravitreale toediening van een AAV die een constitutief actief TrkB (een hersenafgeleide neurotrofe factor receptor) draagt, veroorzaakte een nog langere groei. Nishijima et al. gebruikten bijvoorbeeld een gemanipuleerd TrkB (genaamd F-iTrkB), afgeleverd door AAV, en zagen axonen meer dan 4,5 mm teruggroeien, waarbij sommige het optisch chiasma bereikten (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Op vergelijkbare wijze leidde het inbrengen van een groeibevorderend gen zoals actief K-Ras (een bekend oncogen) in RGC's tot ongeveer 3 mm regeneratie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Interessant genoeg werden er geen tumoren waargenomen in die behandelde ogen, maar de auteurs raden nog steeds aan om induceerbare aan/uit-genomschakelaars te gebruiken voor de veiligheid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Deze en andere studies bevestigen dat het activeren van intrinsieke groeigenen inderdaad regeneratie kan stimuleren in muismodellen van oogzenuwletsel.

Gedeeltelijk Visueel Herstel

De muizenexperimenten volgden vaak niet alleen de anatomie, maar ook de functie. De optomotorische reflex (muizen die bewegende strepen volgen) en dieptezichttests zijn eenvoudige manieren om te zien of het gezichtsvermogen verbetert. In de drievoudige behandelingsstudie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) toonden muizen een gedeeltelijk herstel van deze reflexen. Ze konden opnieuw reageren op bewegende beelden en diepte inschatten, terwijl gewonde muizen zonder behandeling dat niet konden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dit is bemoedigend: het betekent dat de teruggroeide axonen nuttige verbindingen hebben gemaakt. Het herstel was echter slechts gedeeltelijk. Veel visuele paden (vooral fijn beeldvormend zicht) blijven losgekoppeld. Tot nu toe heeft regeneratie de basis visuele responsen hersteld, maar niet het volledige gezichtsvermogen. Toch bevestigt het zien van enige functionele verbetering het potentieel van deze strategieën.

Veiligheidsoverwegingen

Hoewel gentherapie voor regeneratie veelbelovend is, is veiligheid een cruciaal punt van zorg. Dezelfde groeitrajecten die axonen helpen, kunnen ook problemen veroorzaken als ze ongecontroleerd blijven. Zoals opgemerkt, is het permanent verwijderen van PTEN een kankerrisico (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Evenzo kan chronische activering van mTOR leiden tot tumorgroei (bijvoorbeeld, TSC1/2-patiënten krijgen tumoren). Gentherapieën die groeifactoren (zoals gemanipuleerd RAS of andere oncogenen) stimuleren, moeten zorgvuldig worden gecontroleerd. Met name werden in experimentele AAV-RAS-therapie geen tumoren waargenomen in muizenogen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), maar de auteurs benadrukken het gebruik van gereguleerde (induceerbare) systemen voor het geval oncogene activiteit moet worden uitgeschakeld (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Andere veiligheidskwesties zijn celdood en immuunreacties. Sommige interventies schaden bepaalde cellen: zo doodde Sox11-overexpressie veel alfa-type RGC's (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Elke therapie die RGC's doodt, doet afbreuk aan het voordeel ervan. Er is ook het risico op schade door injecties of ontsteking. Het induceren van ontsteking (zymosan) hielp regeneratie bij muizen, maar bij mensen zou het gevaarlijk zijn. Langetermijneffecten van AAV-inserties (zoals insertiemutagenese) zijn laag, maar elke oculaire gentherapie vereist een zorgvuldige beoordeling. Kortom, elk groeibevorderend gen moet worden afgewogen tegen potentiële schade: idealiter tijdelijk of onder strikte controle afgeleverd.

Genafleveringsstrategieën

Het krijgen van genen in de juiste cellen is een belangrijke uitdaging. Voor RGC's zijn adeno-geassocieerde virussen (AAV's) de belangrijkste vectoren. AAV's zijn veilige, niet-replicerende virussen die therapeutische genen in retinale cellen kunnen brengen. Een veelvoorkomende methode is intravitreale injectie: AAV direct in het glasvocht van het oog injecteren. AAV2 is het klassieke serotype voor retinale transductie; het bereikt RGC's efficiënt wanneer het intravitreaal wordt geïnjecteerd (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sterker nog, één studie toonde aan dat intravitreale AAV2 meer dan 90% van de RGC's transdoceerde (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andere capsiden kunnen ook worden gebruikt. AAV6, intravitreaal toegediend, vertoont bijvoorbeeld een zeer hoog tropisme voor het binnenste netvlies en de RGC-laag (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wetenschappers engineeren ook AAV2-varianten (zoals mutaties of chimeren) om retinale barrières nog beter te passeren, maar die details zijn in ontwikkeling.

Een andere route is suprachoroïdale injectie, waarbij een naald of microcanule AAV aflevert tussen de sclera en de choroïd (de vasculaire laag). Deze benadering verspreidt de vector breed onder het netvlies. Suprachoroïdale AAV8 bij apen resulteerde in brede genexpressie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dit kan worden gedaan met speciaal ontworpen micronaalden. Suprachoroïdale toediening vermijdt grote chirurgie, maar is nog steeds invasief en kan lokale ontsteking veroorzaken. Sterker nog, suprachoroïdale AAV8 veroorzaakte milde chorioretinitis (ontsteking van de choroïd) die steroïden vereiste, hoewel het zich in de loop van weken oploste (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Belangrijk is dat suprachoroïdale toediening zwakkere systemische antilichaamresponsen op de AAV-capside veroorzaakte dan intravitreale toediening (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dit komt waarschijnlijk doordat een deel van het virus op een andere manier uit het oog ontsnapt. Over het algemeen is suprachoroïdale injectie veelbelovend voor gentherapie aan de achterkant van het oog, maar de immuuneffecten moeten worden beheerd.

Immunogeniciteit

Hoewel het oog enigszins “immuunprivilege” heeft, kan AAV-gentherapie nog steeds immuunreacties uitlokken. Intravitreale AAV lekt vaak uit het oog via drainagekanalen. Eén studie bij primaten toonde aan dat intravitreale AAV resulteerde in ~400–500 keer meer virus in de bloedbaan vergeleken met subretinale injectie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dit veroorzaakte een zeer sterke antilichaamrespons tegen de AAV-capside (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). In contrast wordt subretinale AAV (geïnjecteerd onder het netvlies) in het oog vastgehouden en veroorzaakt doorgaans vrijwel geen anti-capside antilichamen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprachoroïdale AAV zit hier tussenin: een deel van het virus blijft in het oog, terwijl een deel nabijgelegen weefsels bereikt. Studies tonen aan dat suprachoroïdale AAV mildere anti-capside antilichaamproductie veroorzaakt dan intravitreale (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), maar het kan immuuncellen stimuleren tegen het genproduct (zoals gezien bij GFP) omdat het cellen buiten de bloed-retinale barrière transdoceert (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Naast antilichamen kunnen T-celresponsen getransduceerde cellen aanvallen. Als het ingevoegde gen een eiwit produceert dat het lichaam als vreemd beschouwt (zoals GFP in experimenten), kunnen immuuncellen die cellen opruimen. Zelfs echte menselijke genen kunnen soms een lichte ontsteking veroorzaken. Klinische retinale gentherapietrials (bijv. voor RPE65) geven vaak steroïden om deze respons te dempen. Routes die binnen het netvlies blijven (subretinaal, suprachoroïdaal) zijn over het algemeen minder immunogeen dan glasvochtinjecties (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Toekomstige therapieën zullen een evenwicht moeten vinden tussen efficiënte toediening en minimale immuunactivering, mogelijk met behulp van nieuwere AAV-types of immuunonderdrukkende regimes.

Vertaling naar Glaucoom

Glaucoom vormt een andere uitdaging dan een acute zenuwcompressie. Bij glaucoom sterven RGC's langzaam af door factoren zoals hoge oogdruk, verminderde bloedstroom en stress. Om glaucoom te behandelen, moet gentherapie werken in een chronisch letsel-situatie. Dit betekent dat timing belangrijk is: therapieën moeten mogelijk vroeg worden toegediend om RGC's te beschermen, of periodiek om groeisignalen opnieuw af te stemmen. Gelukkig is er al enig werk begonnen om deze kloof te overbruggen. In een recente studie gebruikten onderzoekers AAV om een altijd-actieve TrkB-receptor (F-iTrkB) in de ogen van glaucoom-modelmuizen af te leveren. Deze muizen vertoonden zowel bescherming van RGC's als aanzienlijke axonregeneratie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dit suggereert dat zelfs onder glaucomateuze omstandigheden, het activeren van groeitrajecten kan helpen.

Toch zullen er meer stappen nodig zijn om van compressiemodellen naar menselijk glaucoom te gaan. We moeten deze gentherapieën testen in dierlijke glaucoommodellen (zoals geïnduceerde oculaire hypertensie of genetische modellen) in plaats van alleen in compressie. We moeten ook rekening houden met veroudering en de zieke omgeving: oudere neuronen, littekenweefsel en fluctuerende oogdruk. Het zal waarschijnlijk nodig zijn om gentherapie te combineren met standaard glaucoombehandeling (drukverlaging, gebruik van neurotrofe factoren) en om gecontroleerde gensystemen te gebruiken. Zoals opgemerkt, zouden AAV-constructen induceerbare promotoren kunnen gebruiken zodat het groeifactor-gen kan worden uitgeschakeld nadat de axonen zijn teruggegroeid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Omdat menselijk glaucoom langzaam vordert, is een enkele geninjectie mogelijk niet voldoende; herhaalde dosering of langwerkende vectoren kunnen nodig zijn. Samenvattend betekent het vertalen van deze bevindingen naar glaucoomtherapie het aanpassen aan de dynamiek van chronisch letsel en het waarborgen dat behandelingen veilig en duurzaam zijn.

Conclusie

Gentherapie die de intrinsieke RGC-routes moduleert, toont veelbelovend potentieel: bij knaagdieren kan het de oogzenuw laten teruggroeien en zelfs enig gezichtsvermogen herstellen. Belangrijke strategieën zoals PTEN/mTOR-activering, KLF4-deletie of Sox11-overexpressie geven elk regeneratieve impulsen via verschillende celprogramma's. Muizenstudies bevestigen dat axonen de hersenen opnieuw kunnen innerveren en eenvoudige visuele taken kunnen verbeteren (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Echter, veiligheidskwesties (oncogeen risico, celverlies, immuunrespons) moeten worden opgelost en toedieningsmethoden verfijnd. Vooruitgang in AAV-vectoren en oculaire injecties biedt hulpmiddelen om RGC's efficiënt te targeten (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Volgende stappen omvatten testen in chronische glaucoommodellen, optimalisatie van dosering en promotoren, en het combineren van gentherapie met glaucoombehandelingen. Al met al ondersteunt het preklinische bewijs sterk verdere ontwikkeling: door intrinsieke groeitrajecten zorgvuldig af te stemmen, kunnen we de vooruitzichten voor herstel van de oogzenuw fundamenteel veranderen.