Úvod

Ztráta zraku v důsledku poškození zrakového nervu nebo glaukomu nastává, protože gangliové buňky sítnice (RGC) nedokážou regenerovat své axony. U dospělých savců je vnitřní růstový program RGC normálně vypnutý, takže poškozené nervy se samy nehojí (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nedávné studie na myších ukazují, že genová terapie může tyto růstové dráhy reaktivovat. Například vymazání genu PTEN (brzda buněčného růstu) u dospělých RGC zapíná růstovou dráhu mTOR a vede k silné regeneraci axonů (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). V tomto článku přezkoumáme, jak manipulace s PTEN/mTOR, geny rodiny KLF a Sox11 může stimulovat regeneraci axonů RGC, čeho se tím dosáhlo u myší, bezpečnostní otázky (jako riziko rakoviny), jak jsou geny dodávány (virové vektory AAV, intravitreální nebo suprachoroidální injekce) a jaké kroky jsou nutné pro přechod od modelů akutního poškození k léčbě chronického glaukomu.

Vnitřní růstové dráhy v RGC

Dráha PTEN/mTOR

Za normálních podmínek udržují dospělé RGC dráhu mTOR převážně vypnutou, což omezuje jejich schopnost růst nové axony (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN je gen, který inhibuje mTOR. Vědci zjistili, že odstranění PTEN u dospělých myších RGC uvolňuje signalizaci mTOR a umožňuje regeneraci axonů (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). V jedné přelomové studii vedlo podmíněné vyřazení PTEN u dospělých myší k robustní regeneraci zrakového nervu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Přibližně 8–10 % přeživších RGC prodloužilo axony o více než 0,5 mm za místo poranění, přičemž některé axony narostly přes 3 mm a dokonce dosáhly optického chiasmatu do 4 týdnů po poranění (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vyřazení další brzdy mTOR, genu TSC1, také indukovalo regeneraci axonů (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Vymazání PTEN nejen podpořilo regeneraci, ale také zlepšilo přežití RGC (přibližně 45 % přežití oproti ~20 % v kontrolních skupinách) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Existuje však bezpečnostní obava: PTEN je tumor supresor. Dlouhodobá ztráta PTEN může podporovat nekontrolovaný buněčný růst. V jedné významné studii regenerace bylo skutečně poznamenáno, že trvalé vymazání PTEN by bylo klinicky nepřijatelné kvůli riziku rakoviny (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pro řešení této otázky vědci navrhují použít kontrolovatelnou genovou terapii (například shRNA dodávanou AAV pod přepínatelným promotoru), aby bylo možné aktivitu PTEN vypnout během regenerace a poté ji znovu zapnout (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Stručně řečeno, PTEN/mTOR je silný vnitřní růstový spínač, ale musí být pečlivě kontrolován.

Rodina KLF a Sox11

Vědci se také zaměřili na transkripční faktory, které řídí růst axonů. Krüppel-like faktory (KLF) jsou rodina takových genů. Klíčovým zjištěním je, že KLF4 působí jako brzda růstu axonů: RGC bez KLF4 rostou lépe než normální (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). U myší, kde RGC nemají KLF4, tyto neurony prodloužily mnohem delší neurity v kultuře a po rozdrcení zrakového nervu vyrostlo mnohem více axonů. Například dva týdny po poranění měly KLF4-knockout myši významně více regenerujících vláken přesahujících 1 mm od místa rozdrcení než myši divokého typu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jiné KLF mají různé role: některé (jako KLF6 a KLF7) podporují růst, zatímco jiné (jako KLF9) jej potlačují (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Proto může vyrovnání exprese KLF odstranit některé vývojové „brzdy“ růstu RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Dalším transkripčním faktorem je Sox11, důležitý ve vývoji. Bylo zjištěno, že naddexpresí Sox11 u dospělých RGC (pomocí AAV genové terapie) se také zvyšuje regenerace. V jedné studii RGC s dodatečným Sox11 prokázaly výrazné zvýšení regenerace axonů po poranění (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sox11 má však smíšené účinky: podporuje regeneraci u některých typů RGC, ale může jiné zabíjet. Je pozoruhodné, že naddexprese Sox11 zabila téměř všechny takzvané „alfa“ RGC (podtyp RGC), které obvykle dobře reagují na léčbu založenou na PTEN (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jinými slovy, Sox11 přeprogramuje některé RGC do stavu schopného růstu, ale také poškozuje jiné (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vědci docházejí k závěru, že různé podtypy RGC vyžadují různé strategie regenerace.

Klíčové studie rozdrcení zrakového nervu u myší

Myší modely poškození zrakového nervu (rozdrcení zrakového nervu) ukázaly, jak tyto genové manipulace fungují v praxi. Klasický přístup kombinoval dráhy pro maximální účinek. V jedné studii PNAS vědci aplikovali tři léčby: vymazání PTEN, vyvolání zánětu v oku (zymosan) a zvýšení cAMP. Toto trio spustilo RGC, aby regenerovaly axony celou cestou přes zrakový nerv do zrakových center mozku (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Při vyšetření mozků léčených myší mnoho regenerujících vláken dosáhlo laterálního genikulárního jádra, horního kolikulu a dalších zrakových oblastí (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Důležité je, že tato regenerace vedla k částečnému obnovení chování souvisejícího se zrakem. Léčené myši získaly zpět určitou schopnost provádět jednoduché zrakové úkoly: dokázaly sledovat pohybující se vzory (optomotorický reflex) a lépe posuzovat hloubku než poraněné kontrolní skupiny (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Dokonce vykazovaly lepší cirkadiánní světelné reakce [20†L33-L38], ačkoli tyto detaily mohou být obtížně měřitelné.) Tato práce prokázala, že regenerace axonů na dlouhé vzdálenosti u dospělých myší může funkčně znovu propojit části zrakového systému.

Další studie se zaměřily na jednotlivé faktory. Intravitreální podání AAV nesoucího konstitutivně aktivní TrkB (receptor pro neurotrofický faktor odvozený z mozku) způsobilo ještě delší růst. Například Nishijima et al. použili upravený TrkB (nazývaný F-iTrkB) dodaný AAV a pozorovali regeneraci axonů přes 4,5 mm, přičemž některé dosáhly optického chiasmatu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Podobně vložení růst podporujícího genu, jako je aktivní K-Ras (dobře známý onkogen), do RGC vedlo k regeneraci asi 3 mm (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Zajímavé je, že u léčených očí nebyly pozorovány žádné nádory, ale autoři stále doporučují používat indukovatelné genové přepínače pro bezpečnost (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tyto a další studie potvrzují, že zapnutí vnitřních růstových genů může skutečně pohánět regeneraci v myších modelech poškození zrakového nervu.

Částečné obnovení zraku

Experimenty na myších často sledovaly nejen anatomii, ale i funkci. Optomotorický reflex (myši sledující pohybující se pruhy) a testy vnímání hloubky jsou jednoduché způsoby, jak zjistit, zda se zrak zlepšuje. Ve studii s trojitou léčbou (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) myši prokázaly částečné obnovení těchto reflexů. Opět dokázaly reagovat na pohybující se vizuály a posuzovat hloubku, zatímco poraněné myši bez léčby nikoliv (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). To je povzbudivé: znamená to, že regenerované axony vytvořily užitečná spojení. Obnova však byla pouze částečná. Mnoho zrakových drah (zejména jemné vidění tvořící obraz) zůstává odpojeno. Zatím regenerace obnovila základní zrakové reakce, ale nikoliv plné vidění. Nicméně jakýkoli funkční zisk potvrzuje potenciál těchto strategií.

Bezpečnostní aspekty

Zatímco genová terapie pro regeneraci je slibná, bezpečnost je kritickým problémem. Stejné růstové dráhy, které pomáhají axonům, mohou také způsobit problémy, pokud zůstanou nekontrolovány. Jak bylo poznamenáno, trvalé vymazání PTEN představuje riziko rakoviny (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Podobně chronická aktivace mTOR může vést k růstu nádorů (například pacienti s TSC1/2 dostávají nádory). Genové terapie, které stimulují růstové faktory (jako upravený RAS nebo jiné onkogeny), musí být pečlivě kontrolovány. Je pozoruhodné, že při experimentální AAV-RAS terapii nebyly v myších očích pozorovány žádné nádory (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ale autoři zdůrazňují použití regulovaných (indukovatelných) systémů pro případ, že by bylo nutné vypnout jakoukoli onkogenní aktivitu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Mezi další bezpečnostní otázky patří buněčná smrt a imunitní reakce. Některé intervence poškozují určité buňky: například naddexprese Sox11 zabila mnoho RGC alfa typu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jakákoli terapie, která zabíjí RGC, ruší svůj přínos. Existuje také riziko poškození způsobeného injekcemi nebo zánětem. Indukce zánětu (zymosan) pomohla regeneraci u myší, ale u lidí by byla nebezpečná. Dlouhodobé účinky AAV inzercí (jako je inzerční mutageneze) jsou nízké, ale každá oční genová terapie vyžaduje pečlivé posouzení. Stručně řečeno, každý gen podporující růst musí být vyvážen proti potenciálnímu poškození: ideálně dodávaný přechodně nebo pod přísnou kontrolou.

Strategie dodávání genů

Dostat geny do správných buněk je klíčovou výzvou. Pro RGC jsou nejčastěji používanými vektory adeno-asociované viry (AAV). AAV jsou bezpečné, nereplikující se viry, které mohou přenášet terapeutické geny do buněk sítnice. Běžnou metodou je intravitreální injekce: injekce AAV přímo do sklivcového gelu oka. AAV2 je klasický sérotyp pro transdukci sítnice; při intravitreální injekci účinně dosahuje RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jedna studie zjistila, že intravitreální AAV2 transdukoval přes 90 % RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lze použít i jiné kapsidy. Například AAV6 podaný intravitreálně vykazuje velmi vysoký tropismus pro vnitřní sítnici a vrstvu RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vědci také vyvíjejí varianty AAV2 (např. mutace nebo chiméry), aby ještě lépe překonávaly retinální bariéry, ale tyto detaily se vyvíjejí.

Další cestou je suprachoroidální injekce, kde je jehlou nebo mikrokanulou AAV dodáván mezi skléru a cévnatku (vaskulární vrstvu). Tento přístup široce rozšiřuje vektor pod sítnici. Suprachoroidální AAV8 u opic vedl k široké genové expresi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lze ji provádět pomocí speciálně navržených mikrojehel. Suprachoroidální podání se vyhýbá velké operaci, ale je stále invazivní a může způsobit lokální zánět. Ve skutečnosti suprachoroidální AAV8 způsobil mírnou chorioretinitidu (zánět cévnatky), která vyžadovala steroidy, ačkoli se během několika týdnů vyřešila (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Důležité je, že suprachoroidální podání vyvolalo slabší systémové protilátkové reakce na kapsidu AAV než intravitreální podání (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). To je pravděpodobně způsobeno tím, že některé viry unikají z oka jiným způsobem. Celkově suprachoroidální injekce slibuje genovou terapii pro zadní část oka, ale její imunitní účinky vyžadují řízení.

Imunogenicita

I když je oko poněkud „imunologicky privilegované“, dodávání genů pomocí AAV může stále vyvolat imunitní reakce. Intravitreální AAV často uniká z oka drenážními kanály. Jedna studie na primátech zjistila, že intravitreální AAV vedl k ~400–500krát většímu množství viru v krevním oběhu ve srovnání se subretinální injekcí (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). To způsobilo velmi silnou protilátkovou odpověď proti kapsidě AAV (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Naopak subretinální AAV (injektovaný pod sítnici) je v oku sekvestrován a obvykle vyvolává téměř žádné protilátky proti kapsidě (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprachoroidální AAV leží někde mezi: část viru zůstává v oku, zatímco část se dostává do okolních tkání. Studie ukazují, že suprachoroidální AAV způsobuje mírnější produkci protilátek proti kapsidě než intravitreální (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ale může stimulovat imunitní buňky proti genovému produktu (jak je vidět u GFP), protože transdukuje buňky mimo krevně-retinální bariéru (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Kromě protilátek mohou T-buněčné reakce napadat transdukované buňky. Pokud vložený gen produkuje protein, který tělo vnímá jako cizí (jako GFP v experimentech), imunitní buňky mohou tyto buňky odstranit. Dokonce i skutečné lidské geny mohou někdy vyvolat nízkou úroveň zánětu. Klinické retinální genové studie (např. pro RPE65) často podávají steroidy k potlačení této reakce. Cesty, které zůstávají uvnitř sítnice (subretinální, suprachoroidální), bývají celkově méně imunogenní než injekce do sklivce (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Budoucí terapie budou muset vyvážit účinné dodávání s minimální aktivací imunitního systému, případně s použitím novějších typů AAV nebo imunosupresivních režimů.

Přenesení poznatků na glaukom

Glaukom představuje jinou výzvu než akutní rozdrcení nervu. U glaukomu RGC pomalu odumírají v důsledku faktorů, jako je vysoký nitrooční tlak, snížený průtok krve a stres. K léčbě glaukomu musí genová terapie fungovat v prostředí chronického poškození. To znamená, že načasování je důležité: terapie mohou být podávány brzy k ochraně RGC, nebo periodicky k opětovnému vyladění růstových signálů. Naštěstí se začíná tento rozdíl překlenovat. V nedávné studii vědci použili AAV k dodání stále aktivního receptoru TrkB (F-iTrkB) do očí myší s modelem glaukomu. Tyto myši vykazovaly jak ochranu RGC, tak značnou regeneraci axonů (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). To naznačuje, že i za glaukomatózních podmínek může aktivace růstových drah pomoci.

Nicméně, přechod od modelů rozdrcení k lidskému glaukomu bude vyžadovat více kroků. Musíme tyto genové terapie testovat na zvířecích modelech glaukomu (jako je indukovaná oční hypertenze nebo genetické modely), spíše než jen na modelech rozdrcení. Musíme také zvážit stárnutí a nemocné prostředí: starší neurony, jizvovou tkáň a kolísavý nitrooční tlak. Pravděpodobně bude nutné kombinovat genovou terapii se standardní péčí o glaukom (snížení tlaku, použití neurotrofických faktorů) a používat kontrolované genové systémy. Například, jak bylo poznamenáno, AAV konstrukty by mohly používat indukovatelné promotory, aby mohl být gen růstového faktoru vypnut po regeneraci axonů (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jelikož lidský glaukom postupuje pomalu, jediná genová injekce nemusí stačit; může být zapotřebí opakované dávkování nebo dlouhodobě působící vektory. Stručně řečeno, převedení těchto zjištění na terapii glaukomu bude znamenat přizpůsobení se dynamice chronického poškození a zajištění bezpečnosti a trvanlivosti léčby.

Závěr

Genová terapie, která moduluje vnitřní dráhy RGC, vykazuje vzrušující potenciál: u hlodavců může způsobit regeneraci zrakového nervu a dokonce obnovit část zraku. Klíčové strategie jako aktivace PTEN/mTOR, vymazání KLF4 nebo naddexprese Sox11 každá poskytují regenerační impulzy prostřednictvím různých buněčných programů. Studie na myších potvrzují, že axony mohou znovu inervovat mozek a zlepšit jednoduché zrakové úkoly (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Je však nutné vyřešit bezpečnostní otázky (onkologické riziko, buněčná ztráta, imunitní odpověď) a zdokonalit metody dodávání. Pokrok ve vektorech AAV a očních injekcích poskytuje nástroje k účinnému zacílení RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Další kroky zahrnují testování na modelech chronického glaukomu, optimalizaci dávkování a promotorů a kombinaci genové terapie s léčbou glaukomu. Celkově předklinické důkazy silně podporují další vývoj: pečlivým laděním vnitřních růstových drah můžeme zásadně změnit vyhlídky na opravu zrakového nervu.