Introduktion

Synförlust på grund av skada på synnerven eller glaukom uppstår eftersom retinala ganglieceller (RGC:er) inte lyckas återbilda sina axoner. Hos vuxna däggdjur stängs RGC:ernas intrinsiska tillväxtprogram normalt av, så skadade nerver läker inte av sig själva (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nya musstudier visar att genterapin kan reaktivera dessa tillväxtvägar. Till exempel, att radera PTEN-genen (en broms på celltillväxt) i vuxna RGC:er aktiverar mTOR-tillväxtvägen och leder till stark axonåterväxt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I den här artikeln granskar vi hur manipulering av PTEN/mTOR, KLF-familjens gener och Sox11 kan stimulera RGC-axonregenerering, vad detta har uppnått i möss, säkerhetsfrågorna (som cancerrisk), hur gener levereras (AAV-virusvektorer, intravitreal eller suprachoroidal injektion) och vilka steg som behövs för att gå från akuta skademodeller till kronisk glaukombehandling.

Intrinsiska tillväxtvägar i RGC:er

PTEN/mTOR-signalvägen

Under normala förhållanden håller vuxna RGC:er mTOR-vägen till stor del inaktiverad, vilket begränsar deras förmåga att växa nya axoner (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN är en gen som hämmar mTOR. Forskare fann att borttagning av PTEN i vuxna mus-RGC:er släpper lös mTOR-signalering och möjliggör axonåterväxt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I en banbrytande studie ledde villkorlig utslagning av PTEN i vuxna möss till robust synnervsregenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cirka 8–10% av de överlevande RGC:erna sträckte ut axoner mer än 0,5 mm förbi skadan, med vissa axoner som växte över 3 mm och till och med nådde synnervskorsningen inom 4 veckor efter skadan (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Utslagning av ytterligare en broms på mTOR, TSC1-genen, inducerade också axonåterväxt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Att radera PTEN stimulerade inte bara återväxt utan förbättrade också RGC-överlevnaden (cirka 45% överlevnad jämfört med ~20% i kontroller) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Det finns dock en säkerhetsrisk: PTEN är en tumörsuppressorgen. Långvarig PTEN-förlust kan främja okontrollerad celltillväxt. En stor regenereringsstudie noterade faktiskt att en permanent radering av PTEN skulle vara kliniskt oacceptabel på grund av cancerrisken (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). För att hantera detta föreslår forskare att man använder kontrollerbar genterapin (till exempel AAV-levererad shRNA under en omkopplingsbar promotor) så att PTEN-aktiviteten kan stängas av under återväxten och sedan slås på igen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kort sagt är PTEN/mTOR en kraftfull intern tillväxtomkopplare, men den måste kontrolleras noggrant.

KLF-familjen och Sox11

Forskare har också riktat in sig på transkriptionsfaktorer som kontrollerar axonutväxt. Krüppel-lika faktorer (KLF:er) är en familj av sådana gener. Ett nyckelfynd är att KLF4 fungerar som en broms på axonutväxt: RGC:er som saknar KLF4 växer bättre än normalt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hos möss som konstruerats så att RGC:er saknar KLF4, sträckte dessa neuroner ut mycket längre neuriter i kultur och, efter krossning av synnerven, växte många fler axoner ut. Till exempel, två veckor efter skadan hade KLF4-knockoutmöss signifikant fler regenererande fibrer bortom 1 mm från krossningsstället än vildtypsmöss (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andra KLF:er har varierande roller: vissa (som KLF6 och KLF7) främjar tillväxt, medan andra (som KLF9) undertrycker den (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Således kan ombalansering av KLF-uttryck lyfta bort några av de utvecklingsmässiga ”bromsarna” på RGC-tillväxt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

En annan transkriptionsfaktor är Sox11, viktig under utvecklingen. Överuttryck av Sox11 i vuxna RGC:er (med AAV-genleverans) visade sig också öka regenereringen. I en studie visade RGC:er med extra Sox11 en markant ökning av axonåterväxt efter skada (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sox11 har dock blandade effekter: det främjar återväxt i vissa RGC-typer men kan döda andra. Särskilt noterbart är att Sox11-överuttryck dödade nästan alla så kallade ”alfa”-RGC:er (en subtyp av RGC) som vanligtvis svarar bra på PTEN-baserade behandlingar (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Med andra ord omprogrammerar Sox11 vissa RGC:er till ett tillväxtkompetent tillstånd, men det skadar också andra (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Forskare drar slutsatsen att olika RGC-subtyper kräver olika återväxtstrategier.

Viktiga musstudier om krossning av synnerven

Musmodeller för skada på synnerven (krossning av synnerven) har visat hur dessa genmanipulationer fungerar i praktiken. Ett klassiskt tillvägagångssätt kombinerade signalvägar för maximal effekt. I en PNAS-studie tillämpade forskare tre behandlingar: radering av PTEN, induktion av inflammation i ögat (zymosan) och förhöjning av cAMP. Denna trio fick RGC:er att återbilda axoner hela vägen genom synnerven och in i hjärnans syncentra (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). När de undersökte hjärnorna hos behandlade möss, nådde många regenererande fibrer den laterala knäkroppen, colliculus superior och andra synområden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Viktigt är att denna återväxt ledde till delvis återhämtning av synrelaterade beteenden. Behandlade möss återfick viss förmåga att utföra enkla visuella uppgifter: de kunde följa rörliga mönster (en optomotorisk reflex) och bedöma djup bättre än skadade kontroller (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (De visade även bättre cirkadiska ljusreaktioner [20†L33-L38], även om dessa detaljer kan vara svåra att mäta.) Detta arbete visade att långdistansaxonregenerering hos vuxna möss funktionellt kan återansluta delar av synsystemet.

Andra studier fokuserade på individuella faktorer. Intravitreal leverans av en AAV som bär en konstitutivt aktiv TrkB (en hjärnrelaterad neurotrofisk faktorreceptor) orsakade ännu längre tillväxt. Till exempel använde Nishijima et al. en modifierad TrkB (kallad F-iTrkB) levererad med AAV och såg axoner återväxa över 4,5 mm, med vissa som nådde synnervskorsningen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). På liknande sätt gav införande av en tillväxtfrämjande gen som aktiv K-Ras (en välkänd onkogen) i RGC:er cirka 3 mm regenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Intressant nog observerades inga tumörer i de behandlade ögonen, men författarna rekommenderar ändå att använda inducerbara på/av-genomkopplare för säkerhet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dessa och andra studier bekräftar att aktivering av intrinsiska tillväxtgener verkligen kan driva regenerering i musmodeller för skada på synnerven.

Delvis synåterhämtning

Musförsöken följde ofta inte bara anatomi utan också funktion. Optomotorisk reflex (möss som följer rörliga ränder) och djupseendetester är enkla sätt att se om synen förbättras. I trippelbehandlingsstudien (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) visade möss delvis återställande av dessa reflexer. De kunde återigen reagera på rörliga bilder och bedöma djup, medan skadade möss utan behandling inte kunde (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Detta är uppmuntrande: det betyder att de återväxta axonerna skapade användbara kopplingar. Återhämtningen var dock endast delvis. Många synvägar (särskilt fin bildformande syn) förblir frånkopplade. Hittills har regenereringen återställt grundläggande synreaktioner, men inte fullständig syn. Ändå bekräftar varje funktionell vinst potentialen i dessa strategier.

Säkerhetsöverväganden

Även om genterapin för regenerering är lovande, är säkerheten en kritisk fråga. Samma tillväxtvägar som hjälper axoner kan också orsaka problem om de lämnas okontrollerade. Som nämnts är permanent radering av PTEN en cancerrisk (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). På samma sätt kan kronisk aktivering av mTOR leda till tumörtillväxt (till exempel får TSC1/2-patienter tumörer). Genterapier som driver tillväxtfaktorer (som modifierad RAS eller andra onkogener) måste kontrolleras noggrant. Särskilt noterbart är att vid experimentell AAV-RAS-terapi observerades inga tumörer i musögon (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), men författarna betonar att man ska använda reglerade (inducerbara) system ifall någon onkogen aktivitet behöver stängas av (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Andra säkerhetsfrågor inkluderar celldöd och immunreaktioner. Vissa interventioner skadar vissa celler: till exempel dödade Sox11-överuttryck många alfa-typ RGC:er (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Varje terapi som dödar RGC:er motverkar dess nytta. Det finns också risk för skador från injektioner eller inflammation. Att inducera inflammation (zymosan) hjälpte regenerering hos möss, men hos människor skulle det vara farligt. Långtidseffekter av AAV-insatser (som insertionell mutagenes) är låga, men all okulär genterapin kräver noggrann bedömning. Kort sagt, varje tillväxtfrämjande gen måste balanseras mot potentiell skada: helst levererad temporärt eller under strikt kontroll.

Strategier för genleverans

Att få gener in i rätt celler är en nyckelutmaning. För RGC:er är adenoassocierade virus (AAV:er) de mest använda vektorerna. AAV:er är säkra, icke-replikerande virus som kan bära terapeutiska gener in i retinala celler. En vanlig metod är intravitreal injektion: att injicera AAV direkt i ögats glaskroppsgel. AAV2 är den klassiska serotypen för retinal transduktion; den når effektivt RGC:er när den injiceras intravitrealt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Faktum är att en studie fann att intravitreal AAV2 transducerade över 90% av RGC:er (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andra kapsider kan också användas. Till exempel visar AAV6, när den ges intravitrealt, en mycket hög tropism för den inre näthinnan och RGC-lagret (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Forskare konstruerar också AAV2-varianter (som mutationer eller kimerer) för att korsa retinala barriärer ännu bättre, men dessa detaljer utvecklas.

En annan väg är suprachoroidal injektion, där en nål eller mikrokanyl levererar AAV mellan sclera och choroid (kärlhinnan). Detta tillvägagångssätt sprider vektorn brett under näthinnan. Suprachoroidal AAV8 hos apor resulterade i brett genuttryck (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Det kan göras med specialdesignade mikronålar. Suprachoroidal leverans undviker större operationer men är fortfarande invasiv och kan orsaka lokal inflammation. Faktum är att suprachoroidal AAV8 orsakade mild korioretinit (inflammation i åderhinnan) som krävde steroider, även om den löste sig över veckor (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Viktigt är att suprachoroidal leverans utlöste svagare systemiska antikroppssvar mot AAV-kapsiden än intravitreal leverans (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Detta beror sannolikt på att en del virus lämnar ögat på ett annat sätt. Sammantaget visar suprachoroidal injektion löfte för genterapin till ögats baksida, men dess immunologiska effekter behöver hanteras.

Immunogenicitet

Även om ögat är något ”immunprivilegierat”, kan AAV-genleverans fortfarande provocera immunreaktioner. Intravitreal AAV läcker ofta ut ur ögat via dränagekanaler. En studie på primater fann att intravitreal AAV resulterade i ~400–500 gånger mer virus i blodomloppet jämfört med subretinal injektion (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Detta orsakade ett mycket starkt antikroppssvar mot AAV-kapsiden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Däremot är subretinal AAV (injicerad under näthinnan) sekvestrerad i ögat och framkallar typiskt nästan inga antikroppar mot kapsiden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprachoroidal AAV ligger däremellan: en del virus stannar i ögat medan en del når närliggande vävnader. Studier visar att suprachoroidal AAV orsakar mildare antikroppsproduktion mot kapsiden än intravitreal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), men den kan stimulera immunceller mot genprodukten (som ses med GFP) eftersom den transducerar celler utanför blod-retinala barriären (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Utöver antikroppar kan T-cellsvar attackera transducerade celler. Om den insatta genen producerar ett protein som kroppen ser som främmande (som GFP i experiment), kan immunceller eliminera dessa celler. Även riktiga mänskliga gener kan ibland utlösa låggradig inflammation. Kliniska retinala gentester (t.ex. för RPE65) ger ofta steroider för att dämpa detta svar. Vägar som stannar inom näthinnan (subretinal, suprachoroidal) tenderar att vara mindre immunogena överlag än glaskroppsinjektioner (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Framtida terapier kommer att behöva balansera effektiv leverans med minimal immunaktivering, eventuellt med hjälp av nyare AAV-typer eller immunsuppressiva regimer.

Översättning till glaukom

Glaukom utgör en annan utmaning än en akut nervkrossning. Vid glaukom dör RGC:er långsamt på grund av faktorer som högt ögontryck, minskat blodflöde och stress. För att behandla glaukom måste genterapin fungera i en kronisk skademiljö. Detta innebär att timing är viktigt: terapier kan behöva ges tidigt för att skydda RGC:er, eller periodiskt för att återställa tillväxtsignaler. Lyckligtvis börjar en del arbete att överbrygga detta gap. I en nyligen genomförd studie använde forskare AAV för att leverera en alltid-på TrkB-receptor (F-iTrkB) in i ögonen på glaukom-modellmöss. Dessa möss visade både skydd av RGC:er och betydande axonregenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Detta tyder på att även under glaukomatösa förhållanden kan aktivering av tillväxtvägar hjälpa.

Att gå från krossningsmodeller till mänskligt glaukom kommer dock att kräva fler steg. Vi måste testa dessa genterapier i djurmodeller för glaukom (som inducerad okulär hypertension eller genetiska modeller) snarare än bara i krossningsmodeller. Vi måste också överväga åldrande och den sjuka miljön: äldre nervceller, ärrvävnad och fluktuerande ögontryck. Det kommer sannolikt att vara nödvändigt att kombinera genterapin med standardglaukomvård (sänkning av tryck, användning av neurotrofa faktorer) och att använda kontrollerade gensystem. Till exempel, som nämnts, skulle AAV-konstruktioner kunna använda inducerbara promotorer så att tillväxtfaktorgenen kan stängas av efter att axoner har återväxt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eftersom mänskligt glaukom utvecklas långsamt kanske en enda geninjektion inte räcker; upprepad dosering eller långvariga vektorer kan behövas. Sammanfattningsvis kommer översättning av dessa fynd till glaukomterapi att innebära anpassning till kroniska skadedynamiker och säkerställande av att behandlingarna är säkra och hållbara.

Slutsats

Genterapin som modulerar RGC:ernas intrinsiska vägar visar spännande potential: hos gnagare kan den få synnerven att växa tillbaka och till och med återställa en del syn. Nyckelstrategier som PTEN/mTOR-aktivering, KLF4-radering eller Sox11-överuttryck ger var och en regenerativa förstärkningar genom olika cellprogram. Musstudier bekräftar att axoner kan reinnervera hjärnan och förbättra enkla visuella uppgifter (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dock måste säkerhetsfrågor (onkogen risk, cellförlust, immunreaktion) lösas, och leveransmetoder förfinas. Framsteg inom AAV-vektorer och okulära injektioner tillhandahåller verktyg för att effektivt rikta in sig på RGC:er (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nästa steg inkluderar testning i kroniska glaukommodeller, optimering av dosering och promotorer, samt kombination av genterapin med glaukombehandlingar. Sammantaget stöder de prekliniska bevisen starkt vidare utveckling: genom att noggrant finjustera intrinsiska tillväxtvägar kan vi i grunden förändra utsikterna för reparation av synnerven.