Introdução

A perda de visão decorrente de lesão do nervo óptico ou glaucoma ocorre porque as células ganglionares da retina (CGRs) falham em regenerar seus axônios. Em mamíferos adultos, o programa de crescimento intrínseco das CGRs é normalmente desativado, de modo que os nervos danificados não se curam por conta própria (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Estudos recentes em camundongos mostram que a terapia gênica pode reativar essas vias de crescimento. Por exemplo, a deleção do gene PTEN (um freio no crescimento celular) em CGRs adultas ativa a via de crescimento mTOR e leva a uma forte regeneração axônica (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Neste artigo, revisamos como a manipulação de PTEN/mTOR, genes da família KLF e Sox11 pode estimular a regeneração de axônios de CGRs, o que isso alcançou em camundongos, as questões de segurança (como o risco de câncer), como os genes são entregues (vetores virais AAV, injeção intravítrea ou supracoroidal) e quais passos são necessários para passar de modelos de lesão aguda para o tratamento crônico do glaucoma.

Vias de Crescimento Intrínseco em CGRs

Via PTEN/mTOR

Em condições normais, as CGRs adultas mantêm a via mTOR em grande parte inativa, o que limita sua capacidade de crescer novos axônios (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN é um gene que inibe o mTOR. Cientistas descobriram que a remoção de PTEN em CGRs de camundongos adultos libera a sinalização de mTOR e permite a regeneração axônica (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Em um estudo marcante, o nocaute condicional de PTEN em camundongos adultos levou a uma regeneração robusta do nervo óptico (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cerca de 8 a 10% das CGRs sobreviventes estenderam axônios por mais de 0,5 mm além da lesão, com alguns axônios crescendo mais de 3 mm e até alcançando o quiasma óptico 4 semanas após a lesão (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nocautear outro freio do mTOR, o gene TSC1, também induziu a regeneração axônica (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

A deleção de PTEN não apenas estimulou a regeneração, mas também melhorou a sobrevida das CGRs (cerca de 45% de sobrevida vs ~20% nos controles) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). No entanto, existe uma preocupação de segurança: PTEN é um supressor tumoral. A perda prolongada de PTEN pode promover o crescimento celular descontrolado. De fato, um grande estudo de regeneração observou que a deleção permanente de PTEN seria clinicamente inaceitável devido ao risco de câncer (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Para resolver isso, os pesquisadores sugerem o uso de terapia gênica controlável (por exemplo, shRNA entregue por AAV sob um promotor comutável) para que a atividade de PTEN possa ser desativada durante a regeneração e depois reativada (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Em suma, PTEN/mTOR é um poderoso interruptor de crescimento interno, mas deve ser cuidadosamente controlado.

Família KLF e Sox11

Pesquisadores também miraram em fatores de transcrição que controlam o crescimento do axônio. Os fatores semelhantes a Krüppel (KLFs) são uma família de tais genes. Uma descoberta chave é que KLF4 atua como um freio no crescimento do axônio: CGRs que não possuem KLF4 crescem melhor do que o normal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Em camundongos geneticamente modificados para que as CGRs não tivessem KLF4, esses neurônios estenderam neurites muito mais longas em cultura e, após o esmagamento do nervo óptico, muito mais axônios cresceram. Por exemplo, duas semanas após a lesão, camundongos com nocaute de KLF4 tinham significativamente mais fibras em regeneração além de 1 mm do local do esmagamento do que camundongos do tipo selvagem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Outros KLFs têm papéis variados: alguns (como KLF6 e KLF7) promovem o crescimento, enquanto outros (como KLF9) o suprimem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Assim, reequilibrar a expressão de KLF pode remover alguns dos “freios” de desenvolvimento no crescimento de CGRs (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Outro fator de transcrição é o Sox11, importante no desenvolvimento. A super expressão de Sox11 em CGRs adultas (usando entrega gênica por AAV) também impulsionou a regeneração. Em um estudo, CGRs com Sox11 extra mostraram um aumento marcante na regeneração axônica após a lesão (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). No entanto, Sox11 tem efeitos mistos: ele promove a regeneração em certos tipos de CGRs, mas pode matar outros. Notavelmente, a super expressão de Sox11 matou quase todas as CGRs do tipo “alfa” (um subtipo de CGR) que geralmente respondem bem a tratamentos baseados em PTEN (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Em outras palavras, Sox11 reprograma algumas CGRs para um estado competente para o crescimento, mas também prejudica outras (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cientistas concluem que diferentes subtipos de CGRs exigem diferentes estratégias de regeneração.

Principais Estudos de Esmagamento do Nervo Óptico em Camundongos

Modelos de camundongos de lesão do nervo óptico (esmagamento do nervo óptico) demonstraram como essas manipulações genéticas funcionam na prática. Uma abordagem clássica combinou vias para o efeito máximo. Em um estudo da PNAS, cientistas aplicaram três tratamentos: deleção de PTEN, indução de inflamação no olho (zimozan) e elevação de cAMP. Este trio impulsionou as CGRs a regenerar axônios por todo o nervo óptico e para os centros visuais do cérebro (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Quando examinaram os cérebros dos camundongos tratados, muitas fibras em regeneração alcançaram o núcleo geniculado lateral, o colículo superior e outras áreas visuais (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). É importante ressaltar que essa regeneração levou a uma recuperação parcial de comportamentos relacionados à visão. Camundongos tratados recuperaram alguma capacidade de realizar tarefas visuais simples: podiam rastrear padrões em movimento (um reflexo optomotor) e julgar a profundidade melhor do que os controles lesionados (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Eles até mostraram melhores respostas circadianas à luz [20†L33-L38], embora esses detalhes possam ser difíceis de medir.) Este trabalho demonstrou que a regeneração axônica de longa distância em camundongos adultos pode reconectar funcionalmente partes do sistema visual.

Outros estudos se concentraram em fatores individuais. A entrega intravítrea de um AAV carregando um TrkB constitutivamente ativo (um receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro) causou um crescimento ainda maior. Por exemplo, Nishijima et al. usaram um TrkB engenheirado (chamado F-iTrkB) entregue por AAV e viram axônios regenerar por mais de 4,5 mm, com alguns alcançando o quiasma óptico (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Similarmente, forçar um gene promotor de crescimento como o K-Ras ativo (um oncogene bem conhecido) em CGRs resultou em cerca de 3 mm de regeneração (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Curiosamente, nenhum tumor foi observado nesses olhos tratados, mas os autores ainda recomendam o uso de interruptores genéticos ligar/desligar indutíveis para segurança (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Esses e outros estudos confirmam que a ativação de genes de crescimento intrínseco pode de fato impulsionar a regeneração em modelos de lesão do nervo óptico em camundongos.

Recuperação Visual Parcial

Os experimentos em camundongos frequentemente rastrearam não apenas a anatomia, mas também a função. O reflexo optomotor (camundongos seguindo listras em movimento) e os testes de percepção de profundidade são maneiras simples de verificar se a visão melhora. No estudo de tratamento triplo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), os camundongos mostraram restauração parcial desses reflexos. Eles puderam novamente responder a visuais em movimento e julgar a profundidade, enquanto camundongos lesionados sem tratamento não puderam (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Isso é encorajador: significa que os axônios regenerados fizeram conexões úteis. No entanto, a recuperação foi apenas parcial. Muitas vias visuais (especialmente a visão de formação de imagem fina) permanecem desconectadas. Até agora, a regeneração restaurou respostas visuais básicas, mas não a visão completa. Ainda assim, ver qualquer ganho funcional confirma o potencial dessas estratégias.

Considerações de Segurança

Embora a terapia gênica para regeneração seja promissora, a segurança é uma preocupação crítica. As mesmas vias de crescimento que ajudam os axônios também podem causar problemas se não forem controladas. Como observado, a deleção permanente de PTEN é um risco de câncer (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Da mesma forma, a ativação crônica de mTOR pode levar ao crescimento tumoral (por exemplo, pacientes com TSC1/2 desenvolvem tumores). Terapias gênicas que impulsionam fatores de crescimento (como RAS engenheirado ou outros oncogenes) devem ser cuidadosamente controladas. Notavelmente, na terapia experimental AAV-RAS, nenhum tumor foi observado nos olhos de camundongos (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), mas os autores enfatizam o uso de sistemas regulados (induzíveis) caso qualquer atividade oncogênica precise ser desativada (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Outras questões de segurança incluem morte celular e reações imunes. Algumas intervenções prejudicam certas células: por exemplo, a super expressão de Sox11 matou muitas CGRs do tipo alfa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Qualquer terapia que mate CGRs anula seu benefício. Há também o risco de danos por injeções ou inflamação. Induzir inflamação (zimozan) ajudou na regeneração em camundongos, mas em humanos seria perigoso. Os efeitos a longo prazo dos insertos de AAV (como a mutagênese insercional) são baixos, mas qualquer terapia gênica ocular precisa de uma avaliação cuidadosa. Em suma, cada gene promotor de crescimento deve ser equilibrado com o dano potencial: idealmente entregue transitoriamente ou sob controle rigoroso.

Estratégias de Entrega Gênica

Levar genes às células certas é um desafio chave. Para as CGRs, os vírus adenoassociados (AAVs) são os vetores de eleição. Os AAVs são vírus seguros e não replicantes que podem transportar genes terapêuticos para as células da retina. Um método comum é a injeção intravítrea: injetar AAV diretamente no gel vítreo do olho. AAV2 é o sorotipo clássico para a transdução retiniana; ele alcança eficientemente as CGRs quando injetado intravitreamente (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). De fato, um estudo descobriu que o AAV2 intravítreo transfectou mais de 90% das CGRs (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Outros capsídeos também podem ser usados. Por exemplo, o AAV6 administrado intravitreamente mostra um tropismo muito alto para a retina interna e a camada de CGRs (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Cientistas também engenheiram variantes de AAV2 (como mutações ou quimeras) para cruzar barreiras retinianas ainda melhor, mas esses detalhes estão em evolução.

Outra via é a injeção supracoroidal, onde uma agulha ou microcânula entrega o AAV entre a esclera e a coroide (a camada vascular). Essa abordagem espalha o vetor amplamente sob a retina. AAV8 supracoroidal em macacos resultou em ampla expressão gênica (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pode ser feito com microneedles especialmente projetadas. A entrega supracoroidal evita cirurgias maiores, mas ainda é invasiva e pode causar inflamação local. De fato, o AAV8 supracoroidal causou leve corioretinite (inflamação da coroide) que exigiu esteroides, embora tenha se resolvido em semanas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). É importante ressaltar que a entrega supracoroidal desencadeou respostas de anticorpos sistêmicos mais fracas à capsídeo de AAV do que a entrega intravítrea (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Isso provavelmente ocorre porque parte do vírus escapa do olho de forma diferente. No geral, a injeção supracoroidal mostra-se promissora para a terapia gênica na parte posterior do olho, mas seus efeitos imunológicos precisam ser gerenciados.

Imunogenicidade

Embora o olho seja de certa forma “imunologicamente privilegiado”, a entrega gênica por AAV ainda pode provocar reações imunes. O AAV intravítreo frequentemente vaza do olho através dos canais de drenagem. Um estudo em primatas descobriu que o AAV intravítreo resultou em cerca de 400 a 500 vezes mais vírus na corrente sanguínea em comparação com a injeção subretiniana (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Isso causou uma resposta muito forte de anticorpos contra a capsídeo do AAV (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Em contraste, o AAV subretiniano (injetado sob a retina) é sequestrado no olho e tipicamente elicita quase nenhum anticorpo anti-capsídeo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). O AAV supracoroidal situa-se entre: parte do vírus permanece no olho, enquanto outra atinge tecidos próximos. Estudos mostram que o AAV supracoroidal causa uma produção mais suave de anticorpos anti-capsídeo do que o intravítreo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), mas pode estimular células imunes contra o produto gênico (como visto com GFP) porque transduz células fora da barreira hematorretiniana (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Além dos anticorpos, as respostas de células T podem atacar células transfectadas. Se o gene inserido produzir uma proteína que o corpo considera estranha (como GFP em experimentos), as células imunes podem eliminar essas células. Mesmo genes humanos reais podem, por vezes, desencadear inflamação de baixo nível. Ensaios clínicos de terapia gênica retiniana (por exemplo, para RPE65) frequentemente administram esteroides para amortecer essa resposta. Rotas que permanecem dentro da retina (subretinal, supracoroidal) tendem a ser menos imunogênicas no geral do que injeções vítreas (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Terapias futuras precisarão equilibrar a entrega eficiente com a mínima ativação imune, possivelmente usando novos tipos de AAV ou regimes imunossupressores.

Transpondo para o Glaucoma

O glaucoma apresenta um desafio diferente do esmagamento agudo do nervo. No glaucoma, as CGRs morrem lentamente devido a fatores como alta pressão ocular, fluxo sanguíneo reduzido e estresse. Para tratar o glaucoma, a terapia gênica deve funcionar em um cenário de lesão crônica. Isso significa que o tempo é importante: as terapias podem precisar ser administradas precocemente para proteger as CGRs, ou periodicamente para reajustar os sinais de crescimento. Felizmente, alguns trabalhos estão começando a preencher essa lacuna. Em um estudo recente, pesquisadores usaram AAV para entregar um receptor TrkB sempre ativo (F-iTrkB) nos olhos de camundongos modelo de glaucoma. Esses camundongos mostraram tanto proteção das CGRs quanto regeneração axônica substancial (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Isso sugere que, mesmo em condições glaucomatosas, a ativação das vias de crescimento pode ajudar.

Ainda assim, passar de modelos de esmagamento para o glaucoma humano exigirá mais etapas. Precisamos testar essas terapias gênicas em modelos animais de glaucoma (como hipertensão ocular induzida ou modelos genéticos) em vez de apenas em esmagamento. Também devemos considerar o envelhecimento e o ambiente doente: neurônios mais velhos, tecido cicatricial e pressão ocular flutuante. Provavelmente será necessário combinar a terapia gênica com os cuidados padrão para o glaucoma (redução da pressão, uso de fatores neurotróficos) e usar sistemas genéticos controlados. Por exemplo, como observado, os construtos de AAV poderiam usar promotores induzíveis para que o gene do fator de crescimento pudesse ser desativado após a regeneração dos axônios (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Como o glaucoma humano progride lentamente, uma única injeção de gene pode não ser suficiente; doses repetidas ou vetores de longa duração podem ser necessários. Em resumo, traduzir essas descobertas para a terapia do glaucoma significará ajustar para a dinâmica da lesão crônica e garantir que os tratamentos sejam seguros e duráveis.

Conclusão

A terapia gênica que modula as vias intrínsecas das CGRs mostra um potencial empolgante: em roedores, ela pode fazer o nervo óptico crescer novamente e até restaurar alguma visão. Estratégias chave como a ativação de PTEN/mTOR, a deleção de KLF4 ou a super expressão de Sox11 fornecem impulsos regenerativos através de diferentes programas celulares. Estudos em camundongos confirmam que os axônios podem reinervar o cérebro e melhorar tarefas visuais simples (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). No entanto, questões de segurança (risco oncogênico, perda celular, resposta imune) devem ser resolvidas, e os métodos de entrega aprimorados. O progresso em vetores AAV e injeções oculares fornece ferramentas para atingir as CGRs eficientemente (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Os próximos passos incluem testes em modelos de glaucoma crônico, otimização de dosagem e promotores, e a combinação da terapia gênica com tratamentos para o glaucoma. No geral, as evidências pré-clínicas apoiam fortemente o desenvolvimento futuro: ao ajustar cuidadosamente as vias de crescimento intrínsecas, podemos mudar fundamentalmente as perspectivas para o reparo do nervo óptico.