Wprowadzenie

Utrata wzroku w wyniku uszkodzenia nerwu wzrokowego lub jaskry następuje, ponieważ komórki zwojowe siatkówki (RGC) nie są w stanie odtworzyć swoich aksonów. U dorosłych ssaków wewnętrzny program wzrostu RGC jest zwykle wyłączony, więc uszkodzone nerwy nie goją się samoistnie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ostatnie badania na myszach pokazują, że terapia genowa może reaktywować te szlaki wzrostu. Na przykład, usunięcie genu PTEN (hamulca wzrostu komórek) w dorosłych RGC aktywuje szlak wzrostowy mTOR i prowadzi do silnej regeneracji aksonów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). W tym artykule przeglądamy, w jaki sposób manipulacja PTEN/mTOR, genami z rodziny KLF i Sox11 może stymulować regenerację aksonów RGC, co osiągnięto w mysich modelach, jakie są kwestie bezpieczeństwa (takie jak ryzyko raka), jak dostarczane są geny (wektory wirusowe AAV, wstrzyknięcie doszklistkowe lub nadnaczyniówkowe) oraz jakie kroki są potrzebne, aby przejść od modeli ostrego urazu do leczenia przewlekłej jaskry.

Wewnętrzne Szlaki Wzrostu w RGC

Szlak PTEN/mTOR

W normalnych warunkach dorosłe RGC utrzymują szlak mTOR w dużej mierze wyłączony, co ogranicza ich zdolność do wzrostu nowych aksonów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN to gen, który hamuje mTOR. Naukowcy odkryli, że usunięcie PTEN w dorosłych RGC myszy uwalnia sygnalizację mTOR i umożliwia regenerację aksonów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). W jednym z przełomowych badań, warunkowe wyłączenie genu PTEN u dorosłych myszy doprowadziło do znaczącej regeneracji nerwu wzrokowego (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Około 8–10% przeżywających RGC wydłużyło aksony o ponad 0,5 mm poza miejsce urazu, a niektóre aksony rosły powyżej 3 mm i nawet dotarły do skrzyżowania wzrokowego w ciągu 4 tygodni po urazie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wyłączenie kolejnego hamulca mTOR, genu TSC1, również wywołało regenerację aksonów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Usunięcie PTEN nie tylko pobudziło regenerację, ale także poprawiło przeżywalność RGC (około 45% przeżywalności w porównaniu do ~20% w grupach kontrolnych) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Istnieje jednak obawa dotycząca bezpieczeństwa: PTEN jest supresorem nowotworowym. Długotrwała utrata PTEN może promować niekontrolowany wzrost komórek. Rzeczywiście, ważne badanie nad regeneracją zauważyło, że trwałe usunięcie PTEN byłoby klinicznie nieakceptowalne ze względu na ryzyko raka (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Aby temu zaradzić, naukowcy sugerują stosowanie kontrolowanej terapii genowej (na przykład shRNA dostarczanego przez AAV pod przełączalnym promotorem), aby aktywność PTEN mogła być wyłączona podczas regeneracji, a następnie ponownie włączona (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Krótko mówiąc, PTEN/mTOR to potężny wewnętrzny przełącznik wzrostu, ale musi być starannie kontrolowany.

Rodzina KLF i Sox11

Naukowcy skupili się również na czynnikach transkrypcyjnych, które kontrolują wzrost aksonów. Czynniki Krüppel-podobne (KLF) to rodzina takich genów. Kluczowym odkryciem jest to, że KLF4 działa jako hamulec wzrostu aksonów: RGC pozbawione KLF4 rosną lepiej niż normalne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). U myszy zmodyfikowanych genetycznie tak, że ich RGC nie posiadają KLF4, neurony te tworzyły znacznie dłuższe neuryty w hodowli, a po zmiażdżeniu nerwu wzrokowego, znacznie więcej aksonów wyrosło. Na przykład, dwa tygodnie po urazie, myszy z wyłączonym KLF4 miały znacznie więcej regenerujących włókien poza 1 mm od miejsca zmiażdżenia niż myszy dzikiego typu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Inne KLF pełnią zróżnicowane role: niektóre (jak KLF6 i KLF7) promują wzrost, podczas gdy inne (jak KLF9) go hamują (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Zatem przywrócenie równowagi w ekspresji KLF może znieść niektóre „hamulce” rozwojowe wzrostu RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Innym czynnikiem transkrypcyjnym jest Sox11, ważny w rozwoju. Stwierdzono również, że nadmierna ekspresja Sox11 w dorosłych RGC (przy użyciu dostarczania genów za pomocą AAV) przyspiesza regenerację. W jednym z badań, RGC z dodatkowym Sox11 wykazały znaczny wzrost regeneracji aksonów po urazie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jednak Sox11 ma mieszane efekty: promuje regenerację w niektórych typach RGC, ale może zabijać inne. Warto zauważyć, że nadmierna ekspresja Sox11 zabiła prawie wszystkie tak zwane RGC typu „alfa” (podtyp RGC), które zazwyczaj dobrze reagują na leczenie oparte na PTEN (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Innymi słowy, Sox11 przeprogramowuje niektóre RGC do stanu zdolnego do wzrostu, ale także szkodzi innym (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Naukowcy wnioskują, że różne podtypy RGC wymagają różnych strategii regeneracji.

Kluczowe Badania nad Zmiażdżeniem Nerwu Wzrokowego u Myszy

Mysie modele uszkodzenia nerwu wzrokowego (zmiażdżenie nerwu wzrokowego) pokazały, jak te manipulacje genetyczne działają w praktyce. Klasyczne podejście łączyło szlaki w celu uzyskania maksymalnego efektu. W jednym z badań PNAS naukowcy zastosowali trzy zabiegi: usunięcie PTEN, wywołanie stanu zapalnego w oku (zymosan) i podniesienie poziomu cAMP. To trio wywołało u RGC regenerację aksonów przez cały nerw wzrokowy aż do ośrodków wzrokowych mózgu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kiedy zbadano mózgi leczonych myszy, wiele regenerujących włókien dotarło do jądra kolankowatego bocznego, wzgórka górnego i innych obszarów wzrokowych (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Co ważne, ta regeneracja doprowadziła do częściowej poprawy zachowań związanych ze wzrokiem. Leczonym myszom powróciła zdolność do wykonywania prostych zadań wzrokowych: mogły śledzić ruchome wzory (odruch optomotoryczny) i lepiej oceniać głębię niż ranne grupy kontrolne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Wykazały nawet lepsze dobowe reakcje na światło [20†L33-L38], choć te szczegóły mogą być trudne do zmierzenia.) Praca ta wykazała, że regeneracja aksonów na długich dystansach u dorosłych myszy może funkcjonalnie ponownie połączyć części układu wzrokowego.

Inne badania skupiły się na pojedynczych czynnikach. Doszklistkowe dostarczenie AAV niosącego konstytutywnie aktywny TrkB (receptor czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego) spowodowało jeszcze dłuższy wzrost. Na przykład Nishijima i wsp. użyli zmodyfikowanego TrkB (nazwanego F-iTrkB) dostarczonego przez AAV i zaobserwowali regenerację aksonów na ponad 4,5 mm, z niektórymi docierającymi do skrzyżowania wzrokowego (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Podobnie, wprowadzenie genu promującego wzrost, takiego jak aktywny K-Ras (dobrze znany onkogen), do RGC spowodowało około 3 mm regeneracji (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Co ciekawe, w leczonych oczach nie zaobserwowano guzów, ale autorzy nadal zalecają stosowanie indukowalnych przełączników genowych włącz/wyłącz dla bezpieczeństwa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Te i inne badania potwierdzają, że aktywacja wewnętrznych genów wzrostu może rzeczywiście napędzać regenerację w mysich modelach uszkodzenia nerwu wzrokowego.

Częściowa Regeneracja Wzroku

Eksperymenty na myszach często śledziły nie tylko anatomię, ale także funkcje. Odruch optomotoryczny (myszy podążające za ruchomymi pasami) i testy percepcji głębi to proste sposoby na sprawdzenie, czy wzrok się poprawia. W badaniu z potrójnym leczeniem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), myszy wykazały częściowe przywrócenie tych odruchów. Mogły ponownie reagować na ruchome obrazy i oceniać głębię, podczas gdy ranne myszy bez leczenia nie były w stanie tego zrobić (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jest to zachęcające: oznacza to, że odtworzone aksony nawiązały użyteczne połączenia. Jednakże, odzyskanie wzroku było tylko częściowe. Wiele szlaków wzrokowych (zwłaszcza tych odpowiadających za precyzyjne widzenie obrazów) pozostaje odłączonych. Do tej pory regeneracja przywróciła podstawowe reakcje wzrokowe, ale nie pełne widzenie. Niemniej jednak, zauważenie jakiegokolwiek funkcjonalnego zysku potwierdza potencjał tych strategii.

Kwestie Bezpieczeństwa

Chociaż terapia genowa w celu regeneracji jest obiecująca, bezpieczeństwo jest kluczową kwestią. Te same szlaki wzrostu, które pomagają aksonom, mogą również powodować problemy, jeśli pozostaną niekontrolowane. Jak zauważono, trwałe usunięcie PTEN wiąże się z ryzykiem raka (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Podobnie, przewlekła aktywacja mTOR może prowadzić do wzrostu guza (na przykład u pacjentów z TSC1/2 rozwijają się guzy). Terapie genowe, które promują czynniki wzrostu (takie jak zmodyfikowany RAS lub inne onkogeny), muszą być starannie kontrolowane. Warto zauważyć, że w eksperymentalnej terapii AAV-RAS nie zaobserwowano guzów w oczach myszy (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ale autorzy podkreślają potrzebę stosowania systemów regulowanych (indukowalnych) w przypadku konieczności wyłączenia jakiejkolwiek aktywności onkogennej (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Inne kwestie bezpieczeństwa obejmują śmierć komórek i reakcje immunologiczne. Niektóre interwencje szkodzą pewnym komórkom: na przykład nadmierna ekspresja Sox11 zabiła wiele RGC typu alfa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Każda terapia, która zabija RGC, niweluje swoje korzyści. Istnieje również ryzyko uszkodzenia w wyniku wstrzyknięć lub stanu zapalnego. Wywołanie stanu zapalnego (zymosan) pomogło w regeneracji u myszy, ale u ludzi byłoby niebezpieczne. Długoterminowe efekty insercji AAV (takie jak mutageneza insercyjna) są niskie, ale każda terapia genowa oka wymaga starannej oceny. Krótko mówiąc, każdy gen promujący wzrost musi być równoważony z potencjalną szkodą: idealnie dostarczany przejściowo lub pod ścisłą kontrolą.

Strategie Dostarczania Genów

Wprowadzenie genów do odpowiednich komórek to kluczowe wyzwanie. Dla RGC, wirusy związane z adenowirusami (AAV) są podstawowymi wektorami. AAV to bezpieczne, nierreplikujące wirusy, które mogą przenosić geny terapeutyczne do komórek siatkówki. Powszechną metodą jest wstrzyknięcie doszklistkowe: wstrzykiwanie AAV bezpośrednio do ciała szklistego oka. AAV2 jest klasycznym serotypem do transdukcji siatkówki; skutecznie dociera do RGC po wstrzyknięciu doszklistkowym (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). W rzeczywistości, jedno badanie wykazało, że doszklistkowe AAV2 transdukowało ponad 90% RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Można również używać innych kapsydów. Na przykład, AAV6 podany doszklistkowo wykazuje bardzo wysoki tropizm dla siatkówki wewnętrznej i warstwy RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Naukowcy inżynieryjnie modyfikują również warianty AAV2 (takie jak mutacje lub chimery), aby jeszcze lepiej przekraczały bariery siatkówki, ale te szczegóły są wciąż rozwijane.

Inną drogą jest wstrzyknięcie nadnaczyniówkowe, gdzie igła lub mikrokaniula dostarcza AAV między twardówkę a naczyniówkę (warstwę naczyniową). To podejście rozprowadza wektor szeroko pod siatkówką. Nadnaczyniówkowe AAV8 u małp zaowocowało szeroką ekspresją genów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Można to zrobić za pomocą specjalnie zaprojektowanych mikroigieł. Dostarczanie nadnaczyniówkowe pozwala uniknąć poważnej operacji, ale nadal jest inwazyjne i może powodować miejscowy stan zapalny. W rzeczywistości, nadnaczyniówkowe AAV8 spowodowało łagodne zapalenie naczyniówki i siatkówki (chorioretinitis), które wymagało podawania sterydów, chociaż ustąpiło po kilku tygodniach (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Co ważne, dostarczanie nadnaczyniówkowe wywołało słabsze ogólnoustrojowe odpowiedzi przeciwciał na kapsyd AAV niż dostarczanie doszklistkowe (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że część wirusa ucieka z oka w inny sposób. Ogólnie rzecz biorąc, wstrzyknięcie nadnaczyniówkowe jest obiecujące w terapii genowej tylnego odcinka oka, ale jego efekty immunologiczne wymagają zarządzania.

Immunogenność

Mimo że oko jest w pewnym stopniu „uprzywilejowane immunologicznie”, dostarczanie genów za pomocą AAV nadal może wywoływać reakcje immunologiczne. Doszklistkowe AAV często wycieka z oka przez kanały drenażowe. Jedno badanie na naczelnych wykazało, że doszklistkowe AAV skutkowało około 400–500 razy większą ilością wirusa w krwiobiegu w porównaniu do wstrzyknięcia podsiatkówkowego (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Spowodowało to bardzo silną odpowiedź przeciwciał skierowanych przeciwko kapsydowi AAV (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Natomiast podsiatkówkowe AAV (wstrzyknięte pod siatkówkę) jest zatrzymywane w oku i zazwyczaj wywołuje prawie brak przeciwciał przeciwkapsydowych (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nadnaczyniówkowe AAV plasuje się pośrodku: część wirusa pozostaje w oku, podczas gdy część dociera do pobliskich tkanek. Badania pokazują, że nadnaczyniówkowe AAV powoduje łagodniejszą produkcję przeciwciał antykapsydowych niż doszklistkowe (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ale może stymulować komórki odpornościowe przeciwko produktowi genu (jak w przypadku GFP), ponieważ transdukuje komórki poza barierą krew-siatkówka (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Oprócz przeciwciał, odpowiedzi limfocytów T mogą atakować przetransdukowane komórki. Jeśli wprowadzony gen wytwarza białko, które organizm postrzega jako obce (takie jak GFP w eksperymentach), komórki odpornościowe mogą usunąć te komórki. Nawet prawdziwe ludzkie geny mogą czasem wywoływać niskiego stopnia stan zapalny. Kliniczne badania genowe siatkówki (np. dla RPE65) często podają sterydy, aby stłumić tę odpowiedź. Drogi, które pozostają w obrębie siatkówki (podsiatkówkowa, nadnaczyniówkowa), są zazwyczaj mniej immunogenne niż wstrzyknięcia do ciała szklistego (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Przyszłe terapie będą musiały równoważyć skuteczne dostarczanie z minimalną aktywacją immunologiczną, być może za pomocą nowszych typów AAV lub schematów immunosupresyjnych.

Przeniesienie na Grunt Jaskry

Jaskra stanowi inne wyzwanie niż ostre zmiażdżenie nerwu. W jaskrze RGC umierają powoli z powodu czynników takich jak wysokie ciśnienie w oku, zmniejszony przepływ krwi i stres. Aby leczyć jaskrę, terapia genowa musi działać w warunkach przewlekłego urazu. Oznacza to, że czas ma znaczenie: terapie mogą wymagać podania wcześnie, aby chronić RGC, lub okresowo, aby ponownie dostroić sygnały wzrostu. Na szczęście, niektóre prace zaczynają wypełniać tę lukę. W niedawnym badaniu, naukowcy użyli AAV do dostarczenia zawsze aktywnego receptora TrkB (F-iTrkB) do oczu myszy z modelem jaskry. Myszy te wykazały zarówno ochronę RGC, jak i znaczną regenerację aksonów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sugeruje to, że nawet w warunkach jaskry, aktywacja szlaków wzrostu może pomóc.

Niemniej jednak, przejście od modeli zmiażdżenia do ludzkiej jaskry będzie wymagało więcej kroków. Musimy przetestować te terapie genowe w zwierzęcych modelach jaskry (takich jak indukowana nadciśnienie oczne lub modele genetyczne), a nie tylko w modelach zmiażdżenia. Musimy również wziąć pod uwagę starzenie się i środowisko chorobowe: starsze neurony, tkankę bliznowatą i zmienne ciśnienie w oku. Prawdopodobnie konieczne będzie połączenie terapii genowej ze standardową opieką w jaskrze (obniżanie ciśnienia, stosowanie czynników neurotroficznych) oraz wykorzystanie kontrolowanych systemów genowych. Na przykład, jak zauważono, konstrukcje AAV mogłyby wykorzystywać indukowalne promotory, tak aby gen czynnika wzrostu mógł być wyłączony po regeneracji aksonów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ponieważ jaskra u ludzi postępuje powoli, pojedyncze wstrzyknięcie genu może nie wystarczyć; mogą być potrzebne powtarzane dawki lub długo działające wektory. Podsumowując, przełożenie tych odkryć na terapię jaskry będzie oznaczało dostosowanie do dynamiki przewlekłego urazu oraz zapewnienie, że leczenie jest bezpieczne i trwałe.

Wnioski

Terapia genowa modulująca wewnętrzne szlaki RGC wykazuje ekscytujący potencjał: u gryzoni może ona spowodować odrastanie nerwu wzrokowego, a nawet przywrócić część wzroku. Kluczowe strategie, takie jak aktywacja PTEN/mTOR, delecja KLF4 lub nadmierna ekspresja Sox11, każda z nich zapewnia impulsy regeneracyjne poprzez różne programy komórkowe. Badania na myszach potwierdzają, że aksony mogą ponownie unerwić mózg i poprawić proste zadania wzrokowe (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jednakże, kwestie bezpieczeństwa (ryzyko onkogenne, utrata komórek, odpowiedź immunologiczna) muszą zostać rozwiązane, a metody dostarczania udoskonalone. Postępy w wektorach AAV i wstrzyknięciach ocznych dostarczają narzędzi do skutecznego celowania w RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kolejne kroki obejmują testowanie w modelach przewlekłej jaskry, optymalizację dawkowania i promotorów oraz łączenie terapii genowej z leczeniem jaskry. Podsumowując, dowody przedkliniczne silnie wspierają dalszy rozwój: poprzez staranne dostrajanie wewnętrznych szlaków wzrostu możemy fundamentalnie zmienić perspektywy naprawy nerwu wzrokowego.