Bevezetés

Az optikai ideg sérülése vagy glaukóma okozta látásvesztés azért következik be, mert a retinális ganglionsejtek (RGC-k) képtelenek axonjaik újranövesztésére. Felnőtt emlősökben az RGC-k belső növekedési programja normális esetben kikapcsolt állapotban van, így a sérült idegek maguktól nem gyógyulnak meg (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Friss egérkutatások kimutatták, hogy a génterápia újraaktiválhatja ezeket a növekedési útvonalakat. Például a PTEN gén (a sejtnövekedés gátlója) eltávolítása felnőtt RGC-kből bekapcsolja az mTOR növekedési útvonalat, és erős axon újranövekedéshez vezet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ebben a cikkben áttekintjük, hogy a PTEN/mTOR, a KLF-család génjeinek és a Sox11 manipulálása hogyan stimulálhatja az RGC axon regenerációját, milyen eredményeket értek el ezzel egerekben, milyen biztonsági problémák merülnek fel (például rákkockázat), hogyan juttatják be a géneket (AAV vírusvektorok, intravitreális vagy szuprachoroidális injekció), és milyen lépések szükségesek az akut sérülési modellekről a krónikus glaukóma kezelésére való átálláshoz.

Belső Növekedési Útvonalak az RGC-kben

PTEN/mTOR Útvonal

Normális körülmények között a felnőtt RGC-k az mTOR útvonalat nagyrészt kikapcsolt állapotban tartják, ami korlátozza új axonok növesztési képességüket (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A PTEN egy gén, amely gátolja az mTOR-t. Tudósok kimutatták, hogy a PTEN eltávolítása felnőtt egér RGC-kből felszabadítja az mTOR jelátvitelt, és lehetővé teszi az axon újranövekedését (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Egy mérföldkőnek számító tanulmányban a PTEN kondicionális kikapcsolása felnőtt egerekben robosztus optikai ideg regenerációhoz vezetett (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A túlélő RGC-k körülbelül 8–10%-a több mint 0,5 mm-rel a sérülésen túlra növesztett axonokat, némelyik axon 3 mm-en túlra is nőtt, és még az optikai kiazmát is elérte 4 héttel a sérülés után (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Az mTOR egy másik gátjának, a TSC1 génnek a kikapcsolása szintén axon újranövekedést indukált (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

A PTEN törlése nemcsak az újranövekedést serkentette, hanem javította az RGC-k túlélését is (körülbelül 45%-os túlélés a kontroll csoport ~20%-ához képest) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Azonban van egy biztonsági aggály: a PTEN egy tumorszuppresszor. A tartós PTEN-hiány kontrollálatlan sejtnövekedést idézhet elő. Valójában egy jelentős regenerációs tanulmány megjegyezte, hogy a PTEN végleges törlése klinikailag elfogadhatatlan lenne a rákkockázat miatt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ennek kezelésére a kutatók szabályozható génterápia alkalmazását javasolják (például kapcsolható promóter alatt AAV által szállított shRNS), így a PTEN aktivitása kikapcsolható a regeneráció során, majd újra bekapcsolható (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Röviden, a PTEN/mTOR egy erős belső növekedési kapcsoló, de gondosan ellenőrizni kell.

KLF Család és Sox11

A kutatók az axon növekedését szabályozó transzkripciós faktorokat is megcélozták. A Krüppel-szerű faktorok (KLF-ek) egy ilyen géncsalád. Egy kulcsfontosságú felfedezés, hogy a KLF4 fékként működik az axon növekedésében: a KLF4-et nélkülöző RGC-k jobban nőnek, mint a normálisak (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Azokban az egerekben, ahol az RGC-k nem rendelkeztek KLF4-gyel, ezek a neuronok sokkal hosszabb neuritokat növesztettek tenyészetben, és az optikai ideg roncsolása után sokkal több axon nőtt ki. Például két héttel a sérülés után a KLF4-knockout egerekben szignifikánsan több regenerálódó rost volt 1 mm-en túl a roncsolás helyétől, mint a vad típusú egerekben (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Más KLF-eknek változatos szerepük van: némelyik (mint a KLF6 és KLF7) elősegíti a növekedést, míg mások (mint a KLF9) elnyomják azt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Így a KLF expresszió egyensúlyának visszaállítása feloldhatja az RGC növekedésének bizonyos fejlődési „fékeit” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Egy másik transzkripciós faktor a fejlődésben fontos Sox11. A Sox11 túlzott expressziója felnőtt RGC-kben (AAV génbevitellel) szintén fokozta a regenerációt. Egy tanulmányban a kiegészítő Sox11-et tartalmazó RGC-k az axon újranövekedésének jelentős növekedését mutatták sérülés után (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Azonban a Sox11 hatásai vegyesek: bizonyos RGC-típusokban elősegíti az újranövekedést, de másokat elpusztíthat. Érdemes megjegyezni, hogy a Sox11 túlzott expressziója szinte az összes úgynevezett „alfa” RGC-t (az RGC-k egy altípusa) elpusztította, amelyek általában jól reagálnak a PTEN-alapú kezelésekre (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Más szóval, a Sox11 egyes RGC-ket növekedésre képes állapotba programoz át, de másoknak árt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A tudósok arra a következtetésre jutottak, hogy a különböző RGC altípusokhoz különböző újranövekedési stratégiákra van szükség.

Kulcsfontosságú Egér Optikai Ideg Roncsolási Tanulmányok

Az optikai ideg sérülésének egérmodelljei (optikai ideg roncsolása) megmutatták, hogyan működnek ezek a génmanipulációk a gyakorlatban. Egy klasszikus megközelítés a maximális hatás érdekében kombinálta az útvonalakat. Egy PNAS tanulmányban a tudósok három kezelést alkalmaztak: PTEN törlését, gyulladás indukálását a szemben (zimozán) és a cAMP szintjének emelését. Ez a trió arra késztette az RGC-ket, hogy axonjaik teljesen végig az optikai idegen és az agy látóközpontjaiba ismét megnőjenek (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Amikor megvizsgálták a kezelt egerek agyát, sok regenerálódó rost elérte a laterális geniculáris magot, a felső ikertestet és más látóterületeket (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Fontos, hogy ez az újranövekedés a látással kapcsolatos viselkedések részleges helyreállításához vezetett. A kezelt egerek részben visszanyerték azon képességüket, hogy egyszerű látási feladatokat végezzenek: képesek voltak mozgó mintákat követni (optomotoros reflex) és jobban megítélni a mélységet, mint a sérült kontroll egerek (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Még jobb cirkadián fényreakciókat is mutattak [20†L33-L38], bár ezeket a részleteket nehéz mérni.) Ez a munka bebizonyította, hogy a hosszú távú axon regeneráció felnőtt egerekben funkcionálisan újra összekapcsolhatja a vizuális rendszer részeit.

Más tanulmányok egyedi tényezőkre összpontosítottak. Az AAV által szállított, konstitutívan aktív TrkB (agy eredetű neurotróf faktor receptor) intravitreális bejuttatása még hosszabb növekedést eredményezett. Például Nishijima et al. egy módosított TrkB-t (F-iTrkB néven) használtak, amelyet AAV-vel juttattak be, és az axonok több mint 4,5 mm-re nőttek vissza, némelyik elérte az optikai kiazmát (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hasonlóképpen, egy növekedést elősegítő gén, mint az aktív K-Ras (egy jól ismert onkogén) RGC-kbe juttatása körülbelül 3 mm regenerációt eredményezett (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Érdekes módon nem figyeltek meg daganatokat a kezelt szemekben, de a szerzők továbbra is javasolják az indukálható on/off génkapcsolók használatát a biztonság érdekében (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ezek és más tanulmányok megerősítik, hogy a belső növekedési gének bekapcsolása valóban elősegítheti a regenerációt az egér optikai ideg sérülési modelljeiben.

Részleges Látáshelyreállítás

Az egérkísérletek gyakran nemcsak az anatómiát, hanem a funkciót is nyomon követték. Az optomotoros reflex (egerek mozgó csíkokat követnek) és a mélységészlelési tesztek egyszerű módjai annak megállapítására, hogy javul-e a látás. A hármas kezelésű tanulmányban (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) az egerek a reflexek részleges helyreállítását mutatták. Ismét képesek voltak reagálni a mozgó vizuális ingerekre és jobban megítélni a mélységet, míg a kezelés nélküli sérült egerek nem (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ez biztató: azt jelenti, hogy az újranőtt axonok hasznos kapcsolatokat létesítettek. Azonban a felépülés csak részleges volt. Sok vizuális útvonal (különösen a finom képeket alkotó látás) továbbra is lekapcsolva maradt. Eddig a regeneráció alapvető vizuális válaszokat állított helyre, de nem teljes látást. Mindazonáltal, bármilyen funkcionális nyereség megerősíti e stratégiák potenciálját.

Biztonsági Megfontolások

Bár a regenerációt célzó génterápia ígéretes, a biztonság kritikus szempont. Ugyanazok a növekedési útvonalak, amelyek segítik az axonokat, problémákat is okozhatnak, ha ellenőrizetlenül maradnak. Amint említettük, a PTEN végleges törlése rákkockázatot jelent (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hasonlóképpen, az mTOR krónikus aktiválása daganatnövekedéshez vezethet (például a TSC1/2 betegeknél daganatok alakulnak ki). A növekedési faktorokat (mint a módosított RAS vagy más onkogének) serkentő génterápiákat gondosan ellenőrizni kell. Érdemes megjegyezni, hogy az experimentális AAV-RAS terápiában nem figyeltek meg daganatokat egérszemben (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), de a szerzők hangsúlyozzák a szabályozott (indukálható) rendszerek használatát, ha bármilyen onkogén aktivitást le kellene állítani (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

További biztonsági problémák közé tartozik a sejthalál és az immunreakciók. Egyes beavatkozások károsítanak bizonyos sejteket: például a Sox11 túlzott expressziója sok alfa-típusú RGC-t elpusztított (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bármely terápia, amely RGC-ket pusztít, ellensúlyozza a hasznát. Fennáll az injekciók vagy gyulladások okozta károsodás kockázata is. A gyulladás indukálása (zimozán) segítette a regenerációt egerekben, de embereknél veszélyes lenne. Az AAV inszertek hosszú távú hatásai (például inszerciós mutagenezis) alacsonyak, de bármely szemészeti génterápia gondos értékelést igényel. Röviden, minden növekedést elősegítő gént egyensúlyba kell hozni a potenciális károkkal: ideális esetben átmenetileg vagy szigorú ellenőrzés alatt kell bejuttatni.

Génbeviteli Stratégiák

A gének megfelelő sejtekbe juttatása kulcsfontosságú kihívás. Az RGC-k esetében az adeno-asszociált vírusok (AAV-k) a leggyakrabban használt vektorok. Az AAV-k biztonságos, nem replikálódó vírusok, amelyek terápiás géneket képesek bejuttatni a retinális sejtekbe. Gyakori módszer az intravitreális injekció: az AAV közvetlenül a szem üvegtestébe történő befecskendezése. Az AAV2 a retinális transzdukció klasszikus szerotípusa; intravitreálisan beadva hatékonyan eljut az RGC-khez (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Valójában egy tanulmány megállapította, hogy az intravitreális AAV2 az RGC-k több mint 90%-át transzduálta (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Más kapszidok is használhatók. Például az intravitreálisan beadott AAV6 nagyon magas tropizmust mutat a belső retina és az RGC réteg iránt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A tudósok az AAV2 variánsokat (például mutációkat vagy kimérákat) is módosítják, hogy még jobban átkeljenek a retinális gátakon, de ezek a részletek folyamatosan fejlődnek.

Egy másik út a szuprachoroidális injekció, ahol egy tű vagy mikrokanül az AAV-t a sclera és a choroid (az érhártya) közé juttatja. Ez a megközelítés széles körben terjeszti a vektort a retina alatt. Az AAV8 szuprachoroidális bejuttatása majmokba széles génexpressziót eredményezett (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ez speciálisan tervezett mikrotűkkel is elvégezhető. A szuprachoroidális bevitel elkerüli a nagyobb műtétet, de továbbra is invazív, és helyi gyulladást okozhat. Valójában a szuprachoroidális AAV8 enyhe chorio-retinitist (az érhártya gyulladását) okozott, amely szteroidokat igényelt, bár hetek alatt elmúlt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Fontos, hogy a szuprachoroidális bevitel gyengébb szisztémás antitestválaszt váltott ki az AAV kapszidra, mint az intravitreális bevitel (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ez valószínűleg azért van, mert egyes vírusok másképp jutnak ki a szemből. Összességében a szuprachoroidális injekció ígéretesnek tűnik a génterápia szempontjából a szem hátsó részére, de immunhatásait kezelni kell.

Immunogenitás

Bár a szem bizonyos mértékig „immunprivilegizált”, az AAV génbevitel továbbra is kiválthat immunreakciókat. Az intravitreális AAV gyakran kiszivárog a szemből a drenázs csatornákon keresztül. Egy főemlősökön végzett tanulmány kimutatta, hogy az intravitreális AAV körülbelül 400-500-szor több vírust eredményezett a véráramban a szubretinális injekcióhoz képest (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ez nagyon erős antitestválaszt váltott ki az AAV kapszid ellen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ezzel szemben a szubretinális AAV (a retina alá injektálva) a szemben izolálódik, és tipikusan szinte egyáltalán nem vált ki anti-kapszid antitesteket (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A szuprachoroidális AAV a kettő között helyezkedik el: része a szemben marad, míg más része eléri a környező szöveteket. Tanulmányok kimutatták, hogy a szuprachoroidális AAV enyhébb anti-kapszid antitest termelést okoz, mint az intravitreális (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), de serkentheti az immunsejteket a géntermék ellen (mint a GFP esetében látható), mert transzduálja a vér-retina gáton kívüli sejteket (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Az antitestek mellett a T-sejtes válaszok is megtámadhatják a transzduált sejteket. Ha a beillesztett gén olyan fehérjét termel, amelyet a szervezet idegennek tekint (mint a GFP a kísérletekben), az immunsejtek eltávolíthatják ezeket a sejteket. Még az igazi emberi gének is kiválthatnak alacsony szintű gyulladást. A klinikai retinális génterápiás vizsgálatok (pl. RPE65 esetében) gyakran adnak szteroidokat a válasz csillapítására. Azok az útvonalak, amelyek a retinán belül maradnak (szubretinális, szuprachoroidális), általában kevésbé immunogének, mint az üvegtestbe adott injekciók (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A jövőbeli terápiáknak egyensúlyba kell hozniuk a hatékony bejuttatást a minimális immunaktiválással, esetleg újabb AAV típusok vagy immunszuppresszív kezelések alkalmazásával.

Glaukómára Való Átültetés

A glaukóma másfajta kihívást jelent, mint egy akut idegroncsolás. Glaukómában az RGC-k lassan halnak el olyan tényezők miatt, mint a magas szembnyomás, a csökkent véráramlás és a stressz. A glaukóma kezeléséhez a génterápiának krónikus sérülési környezetben kell működnie. Ez azt jelenti, hogy az időzítés fontos: a terápiákat korán be kell adni az RGC-k védelmére, vagy rendszeresen megismételni a növekedési jelek finomhangolására. Szerencsére bizonyos munkák már elkezdtek áthidalni ezt a rést. Egy friss tanulmányban a kutatók AAV-t használtak egy folyamatosan aktív TrkB receptor (F-iTrkB) bejuttatására glaukóma-modell egerek szemébe. Ezek az egerek mind az RGC-k védelmét, mind jelentős axon regenerációt mutattak (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ez azt sugallja, hogy még glaukómás állapotokban is segíthet a növekedési útvonalak aktiválása.

Ennek ellenére a roncsolási modellekről az emberi glaukómára való áttérés további lépéseket igényel. Ezeket a génterápiákat állati glaukóma modelleken (például indukált szemnyomás-emelkedéses vagy genetikai modelleken) kell tesztelni, nem csupán roncsolásos modelleken. Figyelembe kell vennünk az öregedést és a beteg környezetet is: öregebb neuronokat, hegképződést és ingadozó szembnyomást. Valószínűleg szükséges lesz a génterápiát kombinálni a standard glaukóma kezeléssel (nyomás csökkentése, neurotróf faktorok alkalmazása) és ellenőrzött génrendszereket használni. Például, amint említettük, az AAV konstrukciók indukálható promótereket használhatnak, így a növekedési faktor gén kikapcsolható az axonok újranövekedése után (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Mivel az emberi glaukóma lassan progrediál, egyetlen géninjekció nem biztos, hogy elegendő; ismételt adagolásra vagy hosszú élettartamú vektorokra lehet szükség. Összefoglalva, ezen eredmények glaukóma terápiába való átültetése azt jelenti, hogy alkalmazkodni kell a krónikus sérülés dinamikájához, és biztosítani kell, hogy a kezelések biztonságosak és tartósak legyenek.

Összefoglalás

Az RGC belső útvonalait moduláló génterápia izgalmas potenciált mutat: rágcsálókban képes az optikai ideget regenerálni és még a látás egy részét is helyreállítani. Kulcsfontosságú stratégiák, mint a PTEN/mTOR aktiváció, a KLF4 törlése vagy a Sox11 túlzott expressziója mindegyike különböző sejtprogramokon keresztül biztosít regeneratív lendületet. Egérkutatások megerősítik, hogy az axonok újra beidegezhetik az agyat és javíthatják az egyszerű vizuális feladatokat (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Azonban a biztonsági kérdéseket (onkogén kockázat, sejtek elvesztése, immunválasz) meg kell oldani, és a beviteli módszereket finomítani kell. Az AAV vektorok és a szemészeti injekciók terén elért fejlődés eszközöket biztosít az RGC-k hatékony célzására (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A következő lépések magukban foglalják a krónikus glaukóma modellekben történő tesztelést, az adagolás és a promóterek optimalizálását, valamint a génterápia glaukóma kezelésekkel való kombinálását. Összességében a preklinikai bizonyítékok erősen támogatják a további fejlesztéseket: a belső növekedési útvonalak gondos hangolásával alapvetően megváltoztathatjuk az optikai ideg helyreállításának kilátásait.