Johdanto

Näönmenetys näköhermovauriosta tai glaukoomasta johtuu siitä, että verkkokalvon ganglionisoluista (RGC) ei kasva uusia aksoneita. Aikuisilla nisäkkäillä RGC:iden sisäinen kasvuohjelma on normaalisti sammutettu, joten vaurioituneet hermot eivät parane itsestään (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Viimeaikaiset hiiritutkimukset osoittavat, että geeniterapia voi aktivoida uudelleen nämä kasvureitit. Esimerkiksi PTEN-geenin (solujen kasvun estäjä) poistaminen aikuisista RGC:istä käynnistää mTOR-kasvureitin ja johtaa voimakkaaseen aksonien uudelleenkasvuun (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tässä artikkelissa tarkastelemme, miten PTEN/mTOR:n, KLF-perheen geenien ja Sox11:n manipulointi voi stimuloida RGC-aksonien uudistumista, mitä tällä on saavutettu hiirillä, turvallisuuskysymyksiä (kuten syöpäriskiä), geenien toimitustapoja (AAV-virusvektorit, lasiaiseen tai suonikalvon yläpuolinen injektio) ja mitä vaiheita tarvitaan siirtyäkseen akuuteista vaurioista kroonisen glaukooman hoitoon.

RGC:iden sisäiset kasvureitit

PTEN/mTOR-reitti

Normaaliolosuhteissa aikuiset RGC:t pitävät mTOR-reitin suurelta osin poissa päältä, mikä rajoittaa niiden kykyä kasvattaa uusia aksoneita (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN on geeni, joka estää mTOR:ää. Tiedemiehet havaitsivat, että PTEN:n poistaminen aikuisen hiiren RGC:istä vapauttaa mTOR-signaloinnin ja mahdollistaa aksonien uudelleenkasvun (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eräässä merkittävässä tutkimuksessa PTEN:n ehdollinen poistaminen aikuisista hiiristä johti voimakkaaseen näköhermon uudistumiseen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Noin 8–10 % eloonjääneistä RGC:istä kasvatti aksoneita yli 0,5 mm vauriokohdan ohi, ja jotkut aksonit kasvoivat yli 3 mm ja jopa saavuttivat näköristeyksen 4 viikkoa vaurion jälkeen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Myös toisen mTOR:n estäjän, TSC1-geenin, poistaminen indusoi aksonien uudelleenkasvua (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

PTEN:n poistaminen ei ainoastaan kiihdyttänyt uudelleenkasvua, vaan myös paransi RGC:iden eloonjäämistä (noin 45 % eloonjäämisaste vs. ~20 % kontrolleissa) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). On kuitenkin turvallisuushuoli: PTEN on kasvainsuppressorigeeni. Pitkäaikainen PTEN:n menetys voi edistää hallitsematonta solujen kasvua. Itse asiassa eräs merkittävä uudistumistutkimus totesi, että PTEN:n pysyvä poistaminen olisi kliinisesti epäkelpoa syöpäriskin vuoksi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tämän korjaamiseksi tutkijat ehdottavat hallittavan geeniterapian käyttöä (esimerkiksi AAV:lla toimitettu shRNA kytkettävän promoottorin alla), jotta PTEN-aktiivisuus voidaan sammuttaa uudelleenkasvun aikana ja kytkeä sitten takaisin päälle (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lyhyesti sanottuna, PTEN/mTOR on tehokas sisäinen kasvukytkin, mutta sitä on valvottava huolellisesti.

KLF-perhe ja Sox11

Tutkijat ovat myös kohdistaneet toimenpiteitä transkriptiotekijöihin, jotka säätelevät aksonien kasvua. Krüppel-tyyppiset tekijät (KLF:t) ovat tällaisten geenien perhe. Keskeinen havainto on, että KLF4 toimii aksonien kasvun jarruna: RGC:t, joista puuttuu KLF4, kasvavat paremmin kuin normaalisti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hiirillä, joilla RGC:istä puuttuu KLF4, nämä neuronit kasvattivat paljon pidempiä neuriteja viljelmissä, ja näköhermon murskautumisen jälkeen paljon enemmän aksoneita kasvoi ulos. Esimerkiksi kaksi viikkoa vamman jälkeen KLF4-poistogeenisillä hiirillä oli merkittävästi enemmän uusiutuvia kuituja yli 1 mm murskautumiskohdasta kuin villityyppisillä hiirillä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Muilla KLF:illä on vaihtelevia rooleja: jotkut (kuten KLF6 ja KLF7) edistävät kasvua, kun taas toiset (kuten KLF9) estävat sitä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Siten KLF-ilmentymän uudelleen tasapainottaminen voi poistaa joitakin kehityksellisiä ”jarruja” RGC-kasvusta (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Toinen transkriptiotekijä on Sox11, joka on tärkeä kehityksessä. Sox11:n yli-ilmentyminen aikuisissa RGC:issä (käyttäen AAV-geenitoimitusta) havaittiin myös tehostavan uudistumista. Eräässä tutkimuksessa RGC:t, joissa oli ylimääräistä Sox11:tä, osoittivat merkittävää aksonien uudelleenkasvua vamman jälkeen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sox11:llä on kuitenkin sekalaisia ​​vaikutuksia: se edistää uudelleenkasvua tietyissä RGC-tyypeissä, mutta voi tappaa toisia. Erityisesti Sox11:n yli-ilmentyminen tappoi lähes kaikki niin sanotut ”alfa”-RGC:t (RGC:n alatyypin), jotka yleensä reagoivat hyvin PTEN-pohjaisiin hoitoihin (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Toisin sanoen Sox11 ohjelmoi joitakin RGC:itä uudelleen kasvukykyiseen tilaan, mutta se vahingoittaa myös muita (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tiedemiehet päättelevät, että eri RGC-alatyyppit vaativat erilaisia uudelleenkasvustrategioita.

Keskeiset hiiritutkimukset näköhermon murskausmallista

Hiirimallit näköhermovauriosta (näköhermon murskautuminen) ovat osoittaneet, miten nämä geenimanipulaatiot toimivat käytännössä. Klassinen lähestymistapa yhdisti reittejä maksimaalisen vaikutuksen saavuttamiseksi. Eräässä PNAS-tutkimuksessa tiedemiehet sovelsivat kolmea hoitoa: PTEN:n poistamista, tulehduksen indusoimista silmään (tsymosaani) ja cAMP:n nostamista. Tämä kolmikko sai RGC:t kasvattamaan aksoneita aina näköhermon läpi ja aivojen näkökeskuksiin (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kun he tutkivat käsiteltyjen hiirten aivoja, monet uudistuneet kuidut saavuttivat lateraalisen polveilevan ytimen, yläkukkulan ja muut näköalueet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tärkeää on, että tämä uudelleenkasvu johti osittaiseen näköön liittyvien käyttäytymisten palautumiseen. Käsitellyt hiiret saivat takaisin osittaisen kyvyn suorittaa yksinkertaisia visuaalisia tehtäviä: ne pystyivät seuraamaan liikkuvia kuvioita (optomotorinen refleksi) ja arvioimaan syvyyttä paremmin kuin vaurioituneet kontrollit (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Ne osoittivat jopa parempia vuorokausirytmin valovasteita [20†L33-L38], vaikka näitä yksityiskohtia voi olla vaikea mitata.) Tämä työ osoitti, että pitkän matkan aksonien uudistuminen aikuisilla hiirillä voi toiminnallisesti yhdistää osia näköjärjestelmästä.

Muut tutkimukset keskittyivät yksittäisiin tekijöihin. AAV:n lasiaiseen toimittaminen, joka kantoi jatkuvasti aktiivista TrkB:tä (aivoperäinen neurotroofinen kasvutekijäreseptori), aiheutti vielä pidempää kasvua. Esimerkiksi Nishijima et al. käyttivät muokattua TrkB:tä (nimeltään F-iTrkB), joka toimitettiin AAV:llä, ja havaitsivat aksonien kasvavan yli 4,5 mm, joidenkin ulottuessa näköristeykseen asti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Samoin, kasvua edistävän geenin, kuten aktiivisen K-Ras (tunnettu onkogeeni), pakottaminen RGC:ihin tuotti noin 3 mm:n uudistumisen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Mielenkiintoista on, että näissä käsitellyissä silmissä ei havaittu kasvaimia, mutta kirjoittajat suosittelevat silti indusoitavien on/off-geenikytkimien käyttöä turvallisuussyistä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nämä ja muut tutkimukset vahvistavat, että sisäisten kasvugeenien aktivoiminen voi todellakin edistää uudistumista hiiren näköhermovauriomalleissa.

Osittainen näön palautuminen

Hiirikokeet seurasivat usein anatomian lisäksi toimintaa. Optomotorinen refleksi (hiiret seuraavat liikkuvia raitoja) ja syvyysnäkötestit ovat yksinkertaisia tapoja nähdä, paraneeko näkö. Kolmoishoitotutkimuksessa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) hiiret osoittivat näiden refleksien osittaista palautumista. Ne pystyivät jälleen reagoimaan liikkuviin kuviin ja arvioimaan syvyyttä, kun taas vahingoittuneet, hoitamattomat hiiret eivät kyenneet tähän (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tämä on rohkaisevaa: se tarkoittaa, että uudelleenkasvaneet aksonit muodostivat hyödyllisiä yhteyksiä. Toipuminen oli kuitenkin vain osittaista. Monet näköreitit (erityisesti tarkka kuvamuodostusnäkö) pysyvät irrotettuina. Toistaiseksi uudistuminen on palauttanut perustason visuaaliset vasteet, mutta ei täyttä näköä. Kuitenkin minkä tahansa toiminnallisen parannuksen näkeminen vahvistaa näiden strategioiden potentiaalin.

Turvallisuusnäkökohdat

Vaikka geeniterapia uudistumiseen on lupaavaa, turvallisuus on kriittinen huolenaihe. Samat kasvureitit, jotka auttavat aksoneita, voivat myös aiheuttaa ongelmia, jos niitä ei valvota. Kuten todettiin, PTEN:n pysyvä poistaminen on syöpäriski (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Samoin mTOR:n krooninen aktivointi voi johtaa kasvaimen kasvuun (esimerkiksi TSC1/2-potilaille kehittyy kasvaimia). Geeniterapiat, jotka edistävät kasvutekijöitä (kuten muunneltu RAS tai muut onkogeenit), on valvottava huolellisesti. Erityisesti kokeellisessa AAV-RAS-terapiassa hiiren silmissä ei havaittu kasvaimia (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), mutta kirjoittajat korostavat säädeltyjen (indusoitavien) järjestelmien käyttöä, jos onkogeeninen aktiivisuus tarvitsee sammuttaa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Muita turvallisuuskysymyksiä ovat solukuolema ja immuunireaktiot. Jotkut toimenpiteet vahingoittavat tiettyjä soluja: esimerkiksi Sox11:n yli-ilmentyminen tappoi monia alfa-tyyppisiä RGC:itä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kaikki hoito, joka tappaa RGC:itä, kumoaa sen hyödyn. On myös vaurioiden riski injektioista tai tulehduksesta. Tulehduksen indusointi (tsymosaani) auttoi uudistumista hiirillä, mutta ihmisillä se olisi vaarallista. AAV-inserttien pitkäaikaiset vaikutukset (kuten insertionaalinen mutageneesi) ovat vähäisiä, mutta kaikki silmän geeniterapia vaatii huolellista arviointia. Lyhyesti sanottuna, jokainen kasvua edistävä geeni on tasapainotettava mahdollisia haittoja vastaan: ihanteellisesti toimitettuna väliaikaisesti tai tiukan valvonnan alaisena.

Geenien toimitusstrategiat

Geenien saaminen oikeisiin soluihin on keskeinen haaste. RGC:iden tapauksessa adeno-assosioidut virukset (AAV:t) ovat yleisimmin käytetyt vektorit. AAV:t ovat turvallisia, monistumattomia viruksia, jotka voivat kuljettaa terapeuttisia geenejä verkkokalvon soluihin. Yleinen menetelmä on lasiaiseen injektointi: AAV:n ruiskuttaminen suoraan silmän lasiaiseen. AAV2 on klassinen serotyyppi verkkokalvon transduktioon; se saavuttaa tehokkaasti RGC:t, kun se injektoidaan lasiaiseen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Itse asiassa yksi tutkimus havaitsi, että lasiaiseen injektoitu AAV2 transduktoi yli 90 % RGC:istä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Myös muita kapsideja voidaan käyttää. Esimerkiksi lasiaiseen annettu AAV6 osoittaa erittäin suurta tropismia sisäiselle verkkokalvolle ja RGC-kerrokselle (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tiedemiehet myös muokkaavat AAV2-variantteja (kuten mutaatioita tai kimeerejä) ylittämään verkkokalvon esteet entistä paremmin, mutta nämä yksityiskohdat kehittyvät.

Toinen reitti on suonikalvon yläpuolinen injektio, jossa neula tai mikrokanuuli toimittaa AAV:n kovakalvon ja suonikalvon (verisuonikerros) väliin. Tämä lähestymistapa levittää vektorin laajalti verkkokalvon alle. Suonikalvon yläpuolinen AAV8 apinoilla johti laajaan geeniekspressioon (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Se voidaan tehdä erityisesti suunnitelluilla mikroneuloilla. Suonikalvon yläpuolinen toimitus välttää suuren leikkauksen, mutta se on edelleen invasiivinen ja voi aiheuttaa paikallista tulehdusta. Itse asiassa suonikalvon yläpuolinen AAV8 aiheutti lievää korioretiniittiä (suonikalvon tulehdusta), joka vaati steroideja, vaikka se parani viikkojen kuluessa (pmc.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tärkeää on, että suonikalvon yläpuolinen toimitus laukaisi heikommat systeemiset vasta-ainevasteet AAV-kapsidille kuin lasiaiseen injektointi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tämä johtuu luultavasti siitä, että osa viruksesta poistuu silmästä eri tavalla. Kaiken kaikkiaan suonikalvon yläpuolinen injektio vaikuttaa lupaavalta geeniterapiassa silmän takaosaan, mutta sen immuunivasteet vaativat hallintaa.

Immunogeenisuus

Vaikka silmä onkin jossain määrin ”immuuniprivilegioitu”, AAV-geenitoimitus voi silti provosoida immuunireaktioita. Lasiaiseen injektoitu AAV vuotaa usein silmästä pois laskukanavien kautta. Eräässä kädellisillä tehdyssä tutkimuksessa havaittiin, että lasiaiseen injektoitu AAV johti ~400–500 kertaa enemmän virusta verenkiertoon verrattuna verkkokalvon alle annettavaan injektioon (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tämä aiheutti erittäin voimakkaan vasta-ainevasteen AAV-kapsidia vastaan (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sen sijaan verkkokalvon alle injektoitu AAV (injektoitu verkkokalvon alle) eristetään silmään ja se yleensä aiheuttaa lähes ei lainkaan anti-kapsidi-vasta-aineita (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suonikalvon yläpuolinen AAV sijoittuu näiden väliin: osa viruksesta jää silmään, kun taas osa saavuttaa lähikudokset. Tutkimukset osoittavat, että suonikalvon yläpuolinen AAV aiheuttaa lievempää anti-kapsidi-vasta-ainetuotantoa kuin lasiaiseen injektoitu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), mutta se voi kiihdyttää immuunisolujen toimintaa geenituotetta vastaan (kuten GFP:n kanssa on havaittu), koska se transduktoi soluja veri-verkkokalvoesteen ulkopuolella (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Vasta-aineiden lisäksi T-soluvasteet voivat hyökätä transduktoitujen solujen kimppuun. Jos insertoitu geeni tuottaa proteiinin, jota keho pitää vieraana (kuten GFP kokeissa), immuunisolut voivat poistaa nämä solut. Jopa todelliset ihmisen geenit voivat joskus laukaista matalan tason tulehduksen. Kliinisissä verkkokalvon geenitutkimuksissa (esim. RPE65:lle) annetaan usein steroideja tämän vasteen vaimentamiseksi. Reitit, jotka pysyvät verkkokalvossa (subretinaali, suprakoroidaalinen), ovat yleisesti ottaen vähemmän immunogeenisiä kuin lasiaiseen annettavat injektiot (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tulevien hoitojen on tasapainotettava tehokas toimitus minimaalisen immuuniaktivaation kanssa, mahdollisesti käyttämällä uusia AAV-tyyppejä tai immunosuppressiivisia hoitoja.

Glaukooman hoitoon siirtyminen

Glaukooma asettaa erilaisen haasteen kuin akuutti hermon murskaus. Glaukoomassa RGC:t kuolevat hitaasti johtuen tekijöistä kuten korkea silmänpaine, vähentynyt verenkierto ja stressi. Glaukooman hoitamiseksi geeniterapian on toimittava kroonisen vamman ympäristössä. Tämä tarkoittaa, että ajoitus on tärkeää: hoitoja on ehkä annettava varhain RGC:iden suojaamiseksi, tai säännöllisesti kasvun signaalien uudelleensäätämiseksi. Onneksi jotakin työtä on jo aloitettu tämän aukon kuromiseksi umpeen. Äskettäisessä tutkimuksessa tutkijat käyttivät AAV:ta toimittaakseen aina aktiivisen TrkB-reseptorin (F-iTrkB) glaukoomamallin hiirten silmiin. Nämä hiiret osoittivat sekä RGC:iden suojausta että merkittävää aksonien uudistumista (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tämä viittaa siihen, että jopa glaukoomatilanteissa kasvureittien aktivoiminen voi auttaa.

Silti siirtyminen murskausmalleista ihmisen glaukoomaan vaatii enemmän vaiheita. Meidän on testattava näitä geeniterapioita eläinten glaukoomamalleissa (kuten indusoidussa silmänpainetaudissa tai geneettisissä malleissa) eikä ainoastaan murskausmalleissa. Meidän on myös otettava huomioon ikääntyminen ja sairas ympäristö: vanhemmat neuronit, arpikudos ja vaihteleva silmänpaine. On todennäköisesti tarpeen yhdistää geeniterapia standardiin glaukoomahoitoon (paineen alentaminen, neurotroofisten tekijöiden käyttö) ja käyttää hallittuja geenijärjestelmiä. Esimerkiksi, kuten todettiin, AAV-konstruktiot voisivat käyttää indusoitavia promoottoreita, jotta kasvutekijägeeni voidaan sammuttaa aksonien uudelleenkasvun jälkeen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Koska ihmisen glaukooma etenee hitaasti, yksi geeninjektio ei välttämättä riitä; toistuva annostelu tai pitkäkestoiset vektorit saattavat olla tarpeen. Yhteenvetona voidaan todeta, että näiden löydösten siirtäminen glaukooman hoitoon tarkoittaa kroonisten vammojen dynamiikan huomioon ottamista ja hoitojen turvallisuuden ja kestävyyden varmistamista.

Johtopäätös

Geeniterapia, joka modifioi RGC:iden sisäisiä reittejä, osoittaa jännittävää potentiaalia: jyrsijöillä se voi saada näköhermon kasvamaan takaisin ja jopa palauttaa osittain näköä. Keskeiset strategiat, kuten PTEN/mTOR-aktivaatio, KLF4:n poisto tai Sox11:n yli-ilmentyminen, antavat kukin uudistumistehosteita eri soluohjelmien kautta. Hiiritutkimukset vahvistavat, että aksonit voivat uudelleenhermottaa aivot ja parantaa yksinkertaisia visuaalisia tehtäviä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Turvallisuuskysymykset (onkogeneesiriski, solukato, immuunivaste) on kuitenkin ratkaistava ja toimitusmenetelmiä on hiottava. AAV-vektoreiden ja silmänsisäisten injektioiden kehitys tarjoaa työkaluja RGC:iden tehokkaaseen kohdentamiseen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Seuraaviin vaiheisiin kuuluvat testaus kroonisissa glaukoomamalleissa, annostuksen ja promoottoreiden optimointi sekä geeniterapian yhdistäminen glaukoomahoitoihin. Kaiken kaikkiaan prekliininen näyttö tukee voimakkaasti jatkokehitystä: säätämällä huolellisesti sisäisiä kasvureittejä voimme pohjimmiltaan muuttaa näköhermon korjaamisen näkymiä.