Introduksjon

Synstap fra skade på synsnerven eller glaukom oppstår fordi retinale ganglieceller (RGC-er) ikke klarer å regenerere sine aksoner. Hos voksne pattedyr er RGC-enes iboende vekstprogram normalt slått av, slik at skadde nerver ikke leges av seg selv (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nylige musestudier viser at genterap kan reaktivere disse vekstbanene. For eksempel, sletting av PTEN-genet (en brems på cellevekst) i voksne RGC-er slår på mTOR-vekstbanen og fører til sterk aksonregjenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I denne artikkelen gjennomgår vi hvordan manipulering av PTEN/mTOR, KLF-familiegener og Sox11 kan stimulere aksonregjenerering i RGC-er, hva dette har oppnådd hos mus, sikkerhetsspørsmålene (som kreftrisiko), hvordan gener leveres (AAV-virusvektorer, intravitreal eller suprakoroidal injeksjon), og hvilke skritt som er nødvendige for å gå fra akutte skademodeller til behandling av kronisk glaukom.

Iboende vekstbaner i RGC-er

PTEN/mTOR-banen

Under normale forhold holder voksne RGC-er mTOR-banen stort sett av, noe som begrenser deres evne til å vokse nye aksoner (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN er et gen som hemmer mTOR. Forskere fant at fjerning av PTEN i RGC-er hos voksne mus frigjør mTOR-signalering og tillater aksonregjenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I en banebrytende studie førte kondisjonell knockout av PTEN i voksne mus til robust synsnerveregenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Omtrent 8–10 % av de overlevende RGC-ene forlenget aksoner mer enn 0,5 mm forbi skaden, med noen aksoner som vokste over 3 mm og til og med nådde chiasma opticum fire uker etter skaden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Å slå ut en annen brems på mTOR, TSC1-genet, induserte også aksonregjenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Sletting av PTEN stimulerte ikke bare regjenerering, men forbedret også RGC-overlevelse (omtrent 45 % overlevelse mot ~20 % i kontroller) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Imidlertid er det en sikkerhetsbekymring: PTEN er en svulstsuppressor. Langvarig PTEN-tap kan fremme ukontrollert cellevekst. En stor regenereringsstudie bemerket faktisk at permanent sletting av PTEN ville være klinisk uakseptabelt på grunn av kreftrisiko (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). For å adressere dette foreslår forskere å bruke kontrollerbar genterap (for eksempel AAV-levert shRNA under en omkoblingsbar promotor) slik at PTEN-aktiviteten kan slås av under regjenerering og deretter på igjen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kort sagt, PTEN/mTOR er en kraftig intern vekstbryter, men den må kontrolleres nøye.

KLF-familien og Sox11

Forskere har også målrettet transkripsjonsfaktorer som kontrollerer aksonvekst. Krüppel-lignende faktorer (KLF-er) er en familie av slike gener. Et nøkkelfunn er at KLF4 fungerer som en brems på aksonvekst: RGC-er som mangler KLF4, vokser bedre enn normalt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hos mus konstruert slik at RGC-er ikke har KLF4, forlenget disse nevronene mye lengre nevritter i kultur, og etter knusning av synsnerven vokste mange flere aksoner ut. For eksempel, to uker etter skade hadde KLF4-knockout-mus betydelig flere regenererende fibre over 1 mm fra skadestedet enn villtype-mus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andre KLF-er har varierte roller: noen (som KLF6 og KLF7) fremmer vekst, mens andre (som KLF9) undertrykker den (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dermed kan rebalansering av KLF-uttrykk fjerne noen av de utviklingsmessige «bremsene» på RGC-vekst (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

En annen transkripsjonsfaktor er Sox11, viktig i utvikling. Overuttrykk av Sox11 i voksne RGC-er (ved hjelp av AAV-genlevering) ble også funnet å øke regjenereringen. I en studie viste RGC-er med ekstra Sox11 en markant økning i aksonregjenerering etter skade (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Imidlertid har Sox11 blandede effekter: det fremmer regjenerering i visse RGC-typer, men kan drepe andre. Spesielt drepte Sox11-overuttrykk nesten alle de såkalte «alfa» RGC-ene (en subtype av RGC) som vanligvis reagerer godt på PTEN-baserte behandlinger (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Med andre ord, Sox11 omprogrammerer noen RGC-er til en vekstkompetent tilstand, men det skader også andre (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Forskere konkluderer med at ulike RGC-subtyper krever forskjellige regjenereringsstrategier.

Viktige studier av knusning av synsnerven hos mus

Musmodeller for skade på synsnerven (knusning av synsnerven) har vist hvordan disse genmanipulasjonene fungerer i praksis. En klassisk tilnærming kombinerte veier for maksimal effekt. I en PNAS-studie anvendte forskere tre behandlinger: sletting av PTEN, indusering av betennelse i øyet (zymosan), og økning av cAMP. Denne trioen utløste RGC-er til å regenerere aksoner hele veien gjennom synsnerven og inn i hjernens visuelle sentre (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Da de undersøkte hjernene til behandlede mus, nådde mange regenererende fibre corpus geniculatum laterale, colliculus superior og andre visuelle områder (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Viktigst, denne regjenereringen førte til delvis gjenoppretting av synsrelatert atferd. Behandlede mus gjenvant en viss evne til å utføre enkle visuelle oppgaver: de kunne spore bevegelige mønstre (en optomotorisk refleks) og bedømme dybde bedre enn skadde kontroller (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (De viste til og med bedre sirkadiske lysresponser [20†L33-L38], selv om disse detaljene kan være vanskelige å måle.) Dette arbeidet demonstrerte at langdistanse aksonregjenerering hos voksne mus funksjonelt kan re-koble deler av synssystemet.

Andre studier fokuserte på individuelle faktorer. Intravitreal levering av en AAV som frakter en konstitutivt aktiv TrkB (en hjerneavledet nevrotrof faktor-reseptor) forårsaket enda lengre vekst. For eksempel brukte Nishijima et al. en konstruert TrkB (kalt F-iTrkB) levert av AAV og så aksoner vokse tilbake over 4,5 mm, med noen som nådde chiasma opticum (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). På samme måte ga det å tvinge et vekstfremmende gen som aktivt K-Ras (et velkjent onkogen) inn i RGC-er, omtrent 3 mm regjenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Interessant nok ble ingen svulster sett i de behandlede øynene, men forfatterne anbefaler fortsatt å bruke induserbare på/av-genbrytere for sikkerhet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Disse og andre studier bekrefter at å slå på iboende vekstgener faktisk kan drive regjenerering i musmodeller for skade på synsnerven.

Delvis synsgjenoppretting

Museeksperimentene sporet ofte ikke bare anatomi, men også funksjon. Den optomotoriske refleksen (mus som følger bevegelige striper) og dybdesynstester er enkle måter å se om synet forbedres. I trippelbehandlingsstudien (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) viste mus delvis gjenoppretting av disse refleksene. De kunne igjen reagere på bevegelige bilder og bedømme dybde, mens skadde mus uten behandling ikke kunne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette er oppmuntrende: det betyr at de regjenererte aksonene dannet nyttige forbindelser. Imidlertid var gjenopprettingen bare delvis. Mange synsbaner (spesielt fin, bildeformende syn) forblir frakoblet. Så langt har regjenerering gjenopprettet grunnleggende synsresponser, men ikke fullt syn. Likevel bekrefter enhver funksjonell gevinst potensialet i disse strategiene.

Sikkerhetsvurderinger

Selv om genterap for regjenerering er lovende, er sikkerhet en kritisk bekymring. De samme vekstbanene som hjelper aksoner, kan også forårsake problemer hvis de ikke kontrolleres. Som nevnt er permanent sletting av PTEN en kreftrisiko (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). På samme måte kan kronisk aktivering av mTOR føre til svulstvekst (for eksempel får TSC1/2-pasienter svulster). Genterapier som fremmer vekstfaktorer (som konstruert RAS eller andre onkogener) må kontrolleres nøye. Spesielt ble det i eksperimentell AAV-RAS-terapi ikke observert svulster i museøyne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), men forfatterne understreker viktigheten av å bruke regulerte (induserbare) systemer i tilfelle onkogen aktivitet må slås av (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Andre sikkerhetsspørsmål inkluderer celledød og immunreaksjoner. Noen intervensjoner skader visse celler: for eksempel drepte Sox11-overuttrykk mange alfa-type RGC-er (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Enhver terapi som dreper RGC-er, opphever dens fordel. Det er også risiko for skade fra injeksjoner eller betennelse. Indusering av betennelse (zymosan) hjalp regjenerering hos mus, men hos mennesker ville det være farlig. Langtidseffekter av AAV-innsettinger (som insertasjonsmutagenese) er lave, men enhver okulær genterap krever nøye vurdering. Kort sagt, hvert vekstfremmende gen må balanseres mot potensiell skade: ideelt levert forbigående eller under streng kontroll.

Genleveringsstrategier

Å få gener inn i de riktige cellene er en nøkkelutfordring. For RGC-er er adeno-assosierte virus (AAV-er) de foretrukne vektorene. AAV-er er trygge, ikke-replikerende virus som kan frakte terapeutiske gener inn i retinale celler. En vanlig metode er intravitreal injeksjon: injisere AAV direkte inn i øyets glasslegeme. AAV2 er den klassiske serotypen for retinal transduksjon; den når effektivt RGC-er når den injiseres intravitrealt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Faktisk fant en studie at intravitreal AAV2 transduserte over 90 % av RGC-ene (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andre kapsider kan også brukes. For eksempel viser AAV6 gitt intravitrealt svært høy tropisme for den indre retina og RGC-laget (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Forskere konstruerer også AAV2-varianter (som mutasjoner eller kimærer) for å krysse retinale barrierer enda bedre, men disse detaljene er i utvikling.

En annen rute er suprakoroidal injeksjon, der en nål eller mikrokanyle leverer AAV mellom sklera og choroidea (årehinnen). Denne tilnærmingen sprer vektoren bredt under retina. Suprakoroidal AAV8 hos aper resulterte i bred genuttrykk (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Det kan gjøres med spesialdesignede mikronåler. Suprakoroidal levering unngår større kirurgi, men er fortsatt invasiv og kan forårsake lokal betennelse. Faktisk forårsaket suprakoroidal AAV8 mild korioretinitt (betennelse i årehinnen) som krevde steroider, selv om det løste seg over uker (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Viktigst, suprakoroidal levering utløste svakere systemiske antistoffresponser mot AAV-kapsidet enn intravitreal levering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette skyldes sannsynligvis at noe virus rømmer fra øyet annerledes. Samlet sett viser suprakoroidal injeksjon lovende resultater for genterap til bakre del av øyet, men dets immuneffekter krever håndtering.

Immunogenisitet

Selv om øyet er noe «immunprivilegert», kan AAV-genlevering fortsatt fremkalle immunreaksjoner. Intravitreal AAV lekker ofte ut av øyet gjennom drenasjekanaler. En studie på primater fant at intravitreal AAV resulterte i ~400–500 ganger mer virus i blodomløpet sammenlignet med subretinal injeksjon (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette forårsaket en svært sterk antistoffrespons mot AAV-kapsidet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I kontrast holdes subretinal AAV (injisert under netthinnen) tilbake i øyet og fremkaller typisk nesten ingen anti-kapsid-antistoffer (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprakoroidal AAV ligger imellom: noe virus forblir i øyet, mens noe når nærliggende vev. Studier viser at suprakoroidal AAV forårsaker mildere anti-kapsid-antistoffproduksjon enn intravitreal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), men det kan stimulere immunceller mot genproduktet (som sett med GFP) fordi det transduserer celler utenfor blod-retina-barrieren (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

I tillegg til antistoffer kan T-celleresponser angripe transduserte celler. Hvis det innsatte genet produserer et protein som kroppen anser som fremmed (som GFP i eksperimenter), kan immunceller fjerne disse cellene. Selv ekte menneskelige gener kan noen ganger utløse lavgradig betennelse. Kliniske retinale gentester (f.eks. for RPE65) gir ofte steroider for å dempe denne responsen. Ruter som forblir innenfor netthinnen (subretinal, suprakoroidal) har en tendens til å være mindre immunogene totalt sett enn intravitreale injeksjoner (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Fremtidige terapier vil måtte balansere effektiv levering med minimal immunaktivering, muligens ved å bruke nyere AAV-typer eller immunsuppressive regimer.

Overføring til glaukom

Glaukom presenterer en annen utfordring enn en akutt nerveskade. I glaukom dør RGC-er sakte på grunn av faktorer som høyt øyetrykk, redusert blodstrøm og stress. For å behandle glaukom må genterap fungere i en setting med kronisk skade. Dette betyr at timing er viktig: terapier kan måtte gis tidlig for å beskytte RGC-er, eller periodisk for å justere vekstsignaler. Heldigvis begynner noe arbeid å bygge bro over dette gapet. I en nylig studie brukte forskere AAV for å levere en alltid-på TrkB-reseptor (F-iTrkB) inn i øynene til glaukom-modellmus. Disse musene viste både beskyttelse av RGC-er og betydelig aksonregjenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette antyder at selv under glaukomatøse forhold, kan aktivering av vekstbaner hjelpe.

Likevel vil overgangen fra knusningsmodeller til humant glaukom kreve flere skritt. Vi må teste disse genterapier i dyremodeller for glaukom (som indusert okulær hypertensjon eller genetiske modeller) i stedet for kun i knusningsmodeller. Vi må også ta hensyn til aldring og det syke miljøet: eldre nevroner, arrvev og svingende øyetrykk. Det vil sannsynligvis være nødvendig å kombinere genterap med standard glaukombehandling (senke trykket, bruke nevrotrofiske faktorer) og å bruke kontrollerte gensystemer. For eksempel, som nevnt, kan AAV-konstruksjoner bruke induserbare promotorer slik at vekstfaktor-genet kan slås av etter at aksonene har vokst tilbake (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Fordi humant glaukom utvikler seg sakte, er en enkelt geninjeksjon kanskje ikke nok; gjentatt dosering eller langvarige vektorer kan være nødvendig. Oppsummert vil overføring av disse funnene til glaukomterapi innebære å justere for kroniske skadedynamikker og sikre at behandlinger er trygge og holdbare.

Konklusjon

Genterap som modulerer RGC-enes iboende veier viser spennende potensial: hos gnagere kan det få synsnerven til å vokse tilbake og til og med gjenopprette noe syn. Nøkkelstrategier som PTEN/mTOR-aktivering, KLF4-sletting, eller Sox11-overuttrykk gir hver for seg regenerative løft gjennom forskjellige celleprogrammer. Musestudier bekrefter at aksoner kan reinnervære hjernen og forbedre enkle visuelle oppgaver (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Imidlertid må sikkerhetsspørsmål (onkogen risiko, celletap, immunrespons) løses, og leveringsmetoder foredles. Fremgang innen AAV-vektorer og okulære injeksjoner gir verktøy for å målrette RGC-er effektivt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Neste skritt inkluderer testing i kroniske glaukommodeller, optimalisering av dosering og promotorer, og kombinasjon av genterap med glaukombehandlinger. Samlet sett støtter det prekliniske beviset sterkt videre utvikling: ved nøye justering av iboende vekstbaner kan vi fundamentalt endre utsiktene for reparasjon av synsnerven.