はじめに

視神経損傷や緑内障による視力喪失は、網膜神経節細胞（RGC）が軸索を再成長させられないために起こります。成体哺乳類では、RGCの内在性成長プログラムは通常停止しており、損傷した神経は自然には治癒しません (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。最近のマウス研究では、遺伝子治療によってこれらの成長経路を再活性化できることが示されています。例えば、成体RGCのPTEN遺伝子（細胞成長のブレーキ役）を欠損させると、mTOR成長経路が活性化され、強力な軸索再生が促進されます (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。この記事では、PTEN/mTOR、KLFファミリー遺伝子、およびSox11の操作がいかにRGC軸索再生を刺激するか、マウスで達成された成果、安全性（がんリスクなど）、遺伝子の送達方法（AAVウイルスベクター、硝子体腔内または脈絡膜上腔注射）、および急性損傷モデルから慢性緑内障治療への移行に必要なステップについて概説します。

RGCにおける内在性成長経路

PTEN/mTOR経路

通常条件下では、成体RGCはmTOR経路をほとんどオフに保っており、新しい軸索を成長させる能力を制限しています (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。PTENはmTORを抑制する遺伝子です。科学者たちは、成体マウスRGCからPTENを除去すると、mTORシグナル伝達が解き放たれ、軸索再生が可能になることを発見しました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。ある画期的な研究では、成体マウスのPTENを条件付きノックアウトすることで、強力な視神経再生がもたらされました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。生存RGCの約8～10%が損傷部位から0.5mm以上軸索を伸長させ、一部の軸索は3mmを超え、損傷後4週間で視交叉に達するものもありました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。mTORの別のブレーキであるTSC1遺伝子をノックアウトすることでも軸索再生が誘発されました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

PTENの欠損は再生を促すだけでなく、RGCの生存率も改善しました（対照群の約20%に対し約45%の生存率） (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。しかし、安全性に関する懸念があります。PTENは腫瘍抑制遺伝子です。PTENの長期的な喪失は、制御不能な細胞成長を促進する可能性があります。実際、ある主要な再生研究では、がんリスクのため、PTENを永続的に欠損させることは臨床的に受け入れられないと指摘されました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。これに対処するため、研究者たちは、再生中にPTEN活性をオフにし、その後オンに戻せるように、制御可能な遺伝子治療（例えば、スイッチ可能なプロモーター下のAAV送達shRNA）の使用を提案しています (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。要するに、PTEN/mTORは強力な内部成長スイッチですが、慎重な制御が必要です。

KLFファミリーとSox11

研究者たちは、軸索成長を制御する転写因子も標的としてきました。クルッペル様因子（KLF）は、そのような遺伝子ファミリーです。重要な発見は、KLF4が軸索成長のブレーキとして機能することです。KLF4を欠損するRGCは、通常よりもよく成長します (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。RGCがKLF4を持たないように遺伝子操作されたマウスでは、これらのニューロンは培養中で非常により長い神経突起を伸長させ、視神経挫滅後にはより多くの軸索が成長しました。例えば、損傷から2週間後、KLF4ノックアウトマウスは、挫滅部位から1mmを超えて再生する線維の数が野生型マウスよりも有意に多かったのです (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。他のKLFには様々な役割があります。一部（KLF6やKLF7など）は成長を促進し、他方（KLF9など）は成長を抑制します (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。したがって、KLF発現のバランスを再調整することで、RGC成長に対する発達上の「ブレーキ」の一部を解除できる可能性があります (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

もう一つの転写因子は、発生において重要な役割を果たすSox11です。成体RGCにおけるSox11の過剰発現（AAV遺伝子送達を使用）もまた、再生を促進することが発見されました。ある研究では、Sox11を追加したRGCは、損傷後に軸索再生が著しく増加しました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。しかし、Sox11には賛否両論の効果があります。特定のRGCタイプでは再生を促進しますが、他のタイプでは死滅させる可能性があります。特に、Sox11の過剰発現は、通常PTENベースの治療によく反応する、いわゆる「アルファ」RGC（RGCのサブタイプ）のほぼすべてを死滅させました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。言い換えれば、Sox11は一部のRGCを成長能力のある状態に再プログラムしますが、他のRGCには害を及ぼします (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。科学者たちは、異なるRGCサブタイプには異なる再生戦略が必要であると結論付けています。

主要なマウス視神経挫滅研究

視神経損傷（視神経挫滅）のマウスモデルは、これらの遺伝子操作が実際にどのように機能するかを示しています。最大の効果を得るために、古典的なアプローチでは経路を組み合わせました。あるPNASの研究では、科学者たちは3つの治療法を適用しました。PTENの欠損、眼内の炎症誘発（チモサン）、およびcAMPの上昇です。この3つの組み合わせにより、RGCは軸索を視神経を完全に貫通し、脳の視覚中枢へ到達するように再生させることができました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。治療を受けたマウスの脳を調べたところ、多くの再生線維が外側膝状体、上丘、その他の視覚野に到達していました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。重要なことに、この再生は視覚関連行動の部分的な回復につながりました。治療を受けたマウスは、単純な視覚タスクを実行する能力を一部取り戻しました。彼らは、移動するパターンを追跡したり（眼球運動反射）、損傷を受けた対照群よりも奥行きをよりよく判断できるようになりました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。（彼らはまた、より良い概日リズムの光応答を示しましたが [20†L33-L38]、これらの詳細は測定が困難な場合があります。）この研究は、成体マウスにおける長距離軸索再生が視覚システムの一部を機能的に再接続できることを示しました。

他の研究では、個々の因子に焦点を当てました。構成的に活性なTrkB（脳由来神経栄養因子受容体）を運ぶAAVを硝子体腔内に送達すると、さらに長い成長が誘発されました。例えば、西島らはAAVによって送達される設計されたTrkB（F-iTrkBと呼ばれる）を使用し、軸索が4.5mm以上再生し、一部は視交叉に達するのを確認しました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。同様に、活性なK-Ras（よく知られた癌遺伝子）のような成長促進遺伝子をRGCに強制的に導入すると、約3mmの再生が得られました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。興味深いことに、治療された眼には腫瘍は見られませんでしたが、著者らは安全のために依然として誘導性オン/オフ遺伝子スイッチの使用を推奨しています (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。これらおよび他の研究は、内在性成長遺伝子を活性化することが、マウス視神経損傷モデルにおける再生を実際に促進することを確認しています。

部分的な視覚回復

マウス実験では、解剖学的構造だけでなく機能も追跡されることがよくあります。眼球運動反射（マウスが移動する縞模様を追跡する）や奥行き知覚テストは、視覚が改善したかどうかを確認する簡単な方法です。3つの治療法を組み合わせた研究 (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) では、マウスはこれらの反射の部分的な回復を示しました。治療を受けない損傷マウスは反応できなかったのに対し、治療を受けたマウスは再び動く視覚刺激に反応し、奥行きを判断できるようになりました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。これは心強い結果です。再生した軸索が有用な接続を形成したことを意味します。しかし、回復は部分的でした。多くの視覚経路（特に微細な画像形成視覚）は切断されたままです。これまでのところ、再生は基本的な視覚応答を回復させましたが、完全な視力には至っていません。それでも、機能的な利益が見られることは、これらの戦略の可能性を裏付けています。

安全性に関する考慮事項

再生のための遺伝子治療は有望ですが、安全性は極めて重要な懸念事項です。軸索の成長を助けるのと同じ成長経路は、制御されないまま放置されると問題を引き起こす可能性もあります。前述のように、PTENを永続的に欠損させることはがんリスクがあります (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。同様に、mTORの慢性的な活性化は腫瘍の成長につながる可能性があります（例えば、TSC1/2患者は腫瘍を発症します）。成長因子（操作されたRASや他の癌遺伝子など）を促進する遺伝子治療は、慎重に制御される必要があります。注目すべきことに、実験的なAAV-RAS療法では、マウスの眼に腫瘍は観察されませんでしたが (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)、著者らは、癌原性活性を停止する必要がある場合に備えて、制御された（誘導性）システムの使用を強調しています (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

その他の安全性に関する問題には、細胞死と免疫反応があります。一部の介入は特定の細胞に害を及ぼします。例えば、Sox11の過剰発現は多くのアルファ型RGCを死滅させました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。RGCを死滅させる治療法は、その利益を相殺します。また、注射や炎症による損傷のリスクもあります。炎症誘発（チモサン）はマウスの再生を助けましたが、ヒトでは危険です。AAV挿入（挿入変異誘発など）の長期的な影響は低いですが、いかなる眼内遺伝子治療も慎重な評価が必要です。要するに、各成長促進遺伝子は潜在的な害とバランスを取る必要があります。理想的には、一時的に、または厳密な制御下で送達されるべきです。

遺伝子送達戦略

遺伝子を適切な細胞に送達することは主要な課題です。RGCの場合、アデノ随伴ウイルス（AAV）が主力ベクターです。AAVは安全で非増殖性のウイルスであり、治療用遺伝子を網膜細胞に運ぶことができます。一般的な方法の1つは硝子体腔内注射です。これは、AAVを眼の硝子体ゲルに直接注射することです。AAV2は網膜形質導入の古典的な血清型であり、硝子体腔内注射で効率的にRGCに到達します (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。実際、ある研究では、硝子体腔内AAV2がRGCの90%以上を形質導入したことが分かりました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。他のカプシドも使用できます。例えば、硝子体腔内投与されたAAV6は、内網膜およびRGC層に対して非常に高い指向性を示します (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。科学者たちはまた、網膜バリアをより効果的に通過させるためにAAV2の変異体（変異体やキメラなど）を設計していますが、その詳細は進化途上にあります。

もう一つの経路は脈絡膜上腔注射です。これは、針またはマイクロカニューレによってAAVを強膜と脈絡膜（血管層）の間に送達する方法です。このアプローチは、網膜下にベクターを広く拡散させます。サルにおける脈絡膜上腔AAV8は広範囲の遺伝子発現をもたらしました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。これは、特別に設計されたマイクロニードルで行うことができます。脈絡膜上腔送達は大規模な手術を回避しますが、依然として侵襲的であり、局所的な炎症を引き起こす可能性があります。実際、脈絡膜上腔AAV8は軽度の脈絡膜網膜炎（脈絡膜の炎症）を引き起こし、ステロイド治療を必要としましたが、数週間で解消しました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。重要なことに、脈絡膜上腔送達は、硝子体腔内送達よりもAAVカプシドに対する全身性抗体応答を弱く誘発しました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。これは、一部のウイルスが眼から異なる経路で漏出するためと考えられます。全体として、脈絡膜上腔注射は眼の奥への遺伝子治療に有望ですが、その免疫学的効果の管理が必要です。

免疫原性

眼はいくらか「免疫特権」を持つとはいえ、AAV遺伝子送達は依然として免疫反応を誘発する可能性があります。硝子体腔内AAVは、しばしば排水路を通じて眼から漏出します。霊長類のある研究では、硝子体腔内AAVが、網膜下注射と比較して血流中に約400～500倍多くのウイルスをもたらすことが判明しました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。これは、AAVカプシドに対する非常に強い抗体応答を引き起こしました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。対照的に、網膜下AAV（網膜下に注射される）は眼内に隔離され、通常、抗カプシド抗体をほとんど誘発しません (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。脈絡膜上腔AAVはその中間です。一部のウイルスは眼内に留まりますが、一部は近傍組織に到達します。研究によると、脈絡膜上腔AAVは硝子体腔内AAVよりも軽度の抗カプシド抗体産生を引き起こしますが (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)、血液網膜関門外の細胞を形質導入するため、遺伝子産物（実験におけるGFPなど）に対する免疫細胞を刺激する可能性があります (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。

抗体に加えて、T細胞応答が形質導入された細胞を攻撃する可能性があります。挿入された遺伝子が身体によって異物と見なされるタンパク質（実験におけるGFPなど）を産生する場合、免疫細胞がそれらの細胞を除去する可能性があります。実際のヒト遺伝子でも、低レベルの炎症を引き起こすことがあります。臨床網膜遺伝子治療試験（例：RPE65用）では、この応答を抑制するためにステロイドがしばしば投与されます。網膜内に留まる経路（網膜下、脈絡膜上腔）は、硝子体注射よりも全体的に免疫原性が低い傾向があります (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。将来の治療法では、効率的な送達と最小限の免疫活性化のバランスを取る必要があります。これは、新しいAAVタイプや免疫抑制レジメンの使用によって可能になるかもしれません。

緑内障への応用

緑内障は、急性の神経挫滅とは異なる課題を提示します。緑内障では、眼圧の上昇、血流の減少、ストレスなどの要因によりRGCがゆっくりと死滅します。緑内障を治療するには、遺伝子治療が慢性的な損傷環境で機能する必要があります。これは、タイミングが重要であることを意味します。RGCを保護するため、または成長シグナルを再調整するために、治療を早期に、または定期的に投与する必要があるかもしれません。幸いなことに、このギャップを埋める研究が始まっています。最近の研究では、研究者たちはAAVを使用して、常に活性なTrkB受容体（F-iTrkB）を緑内障モデルマウスの眼に送達しました。これらのマウスは、RGCの保護と実質的な軸索再生の両方を示しました (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。これは、緑内障の状況下でも、成長経路を活性化することが役立つ可能性を示唆しています。

しかし、挫滅モデルからヒトの緑内障への移行には、さらに多くのステップが必要です。これらの遺伝子治療は、挫滅モデルだけでなく、動物の緑内障モデル（誘導性眼内高血圧や遺伝子モデルなど）でテストする必要があります。また、老化や病気の環境（老化したニューロン、瘢痕組織、変動する眼圧など）も考慮しなければなりません。遺伝子治療を標準的な緑内障治療（眼圧降下、神経栄養因子使用）と組み合わせ、制御された遺伝子システムを使用することがおそらく必要になるでしょう。例えば、前述のように、AAV構築物は誘導性プロモーターを使用して、軸索が再生した後に成長因子遺伝子をオフにできるようにすることができます (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。ヒトの緑内障はゆっくりと進行するため、1回の遺伝子注射では不十分な場合があり、反復投与または持続性の高いベクターが必要になるかもしれません。要約すると、これらの知見を緑内障治療に応用するには、慢性損傷の動態に対応し、治療が安全で持続可能であることを保証する必要があります。

結論

RGC内在性経路を調節する遺伝子治療は、エキサイティングな可能性を示しています。げっ歯類では、視神経を再生させ、さらには一部の視力を回復させることができます。PTEN/mTOR活性化、KLF4欠損、またはSox11過剰発現などの主要な戦略は、それぞれ異なる細胞プログラムを通じて再生を促進します。マウス研究では、軸索が脳を再神経支配し、単純な視覚タスクを改善できることが確認されています (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。しかし、安全性に関する問題（発癌リスク、細胞死、免疫応答）を解決し、送達方法を洗練する必要があります。AAVベクターと眼内注射の進歩は、RGCを効率的に標的とするツールを提供します (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)。次のステップには、慢性緑内障モデルでの試験、投与量とプロモーターの最適化、および遺伝子治療と緑内障治療の組み合わせが含まれます。総合的に見て、前臨床のエビデンスはさらなる開発を強力に支持しています。内在性成長経路を慎重に調整することで、視神経修復の見通しを根本的に変えることができるかもしれません。