Bevezetés

A glaukóma az visszafordíthatatlan vakság vezető oka világszerte, mivel a szemet az aggyal összekötő retinális ganglionsejtek (RGC-k) elpusztulnak és nem képesek regenerálódni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). RGC-k nélkül a retinából érkező vizuális jelek nem juthatnak el az agyi központokba (mint például a laterális geniculáris mag és a felső ikertest), így a látás elveszik. A jelenlegi glaukóma kezelések (pl. a szemnyomás csökkentése) megvédhetik a túlélő RGC-ket, de a már elveszetteket nem képesek helyreállítani (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Az őssejtterápia célja az elveszett RGC-k pótlása humán pluripotens őssejtek (akár embrionális őssejtek, ESC-k, akár indukált pluripotens őssejtek, iPSC-k) RGC-kké történő differenciálásával és szembe történő transzplantációjával (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Elvileg ez a retinális neuronok korlátlan forrását biztosíthatná (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). De ennek a látomásnak a megvalósítása hatalmas kihívások leküzdését igényli: az új RGC-knek túl kell élniük, axonokat kell növeszteniük a szem kilépési pontján (a lamina cribrosa) keresztül a látóidegbe, nagy távolságokat kell megtenniük precíz agyi célpontokig, funkcionális szinapszisokat kell képezniük, és mielinizálódniuk kell – mindezt a felnőtt központi idegrendszer gátló környezetében.

Ez a cikk áttekinti a humán őssejtekből származó RGC-k előállításának és állatmodellekbe történő transzplantációjának jelenlegi állását. Ezt követően megvitatjuk a siker kritikus akadályait – az axonok kiterjesztését a lamina cribrosán keresztül, a thalamikus és collicularis célpontokhoz való irányítást, a szinapszisképződést és a mielinizációt –, valamint a biztonsági kérdéseket (immunrejekció, daganat kockázata) és a beadási módszereket (intravitreális vs. szubretinális injekció). Végezetül reális kilátásokat vázolunk fel arra vonatkozóan, hogy mikor válhatnak megvalósíthatóvá az első „emberen végzett” glaukóma-vizsgálatok, és milyen eredményességi mérőszámokat igényelnének. Végig a tisztaságra törekszünk: a kulcsfontosságú kifejezések félkövéren szerepelnek, és minden technikai fogalmat elmagyarázunk a laikus közönség számára.

RGC-k differenciálása humán pluripotens őssejtekből

A tudósok számos protokollt fejlesztettek ki a humán ESC-k vagy iPSC-k RGC-szerű neuronokká történő átalakítására. Jellemzően az őssejteket először retinális progenitor állapotba irányítják növekedési faktorok és kismolekulák kombinációival, amelyek utánozzák a szem fejlődését (például FGF, IGF, BMP, Wnt és Notch útvonal modulátorok) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Megfelelő körülmények között ezek a sejtek tovább differenciálódnak RGC-kké, amit RGC markerek igazolhatnak. Kulcsfontosságú markerek közé tartoznak a BRN3B (POU4F2) és ISL1 transzkripciós faktorok, az RBPMS RNS-kötő fehérje, a β-III tubulin (TUJ1) neuronális citoszkeletális fehérje és a szinuklein-γ (SNCG). Valójában egy tanulmány kimutatta, hogy a PSC-ből származó kultúrák számos RGC markert expresszálnak: „transzkripciós faktorok, mint a BRN3, ISL1 és SNCG” jelentek meg hosszú neuritek mellett, megerősítve az RGC identitást (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ezek az őssejtből származó RGC-k génexpresszióban és morfológiában hasonlítanak természetes megfelelőikre, hosszú nyúlványokat bocsátanak ki és akciós potenciálokat generálnak.

Az RGC-k nem egységes sejttípusok. RGC altípusok tucatjai léteznek (pl. mozgásérzékeny irányválogató sejtek, on/off központi sejtek, belsőleg fényérzékeny melanopszin sejtek, alfa-RGC-k stb.), mindegyik sajátos funkciókkal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Állatkísérletek 30-nál több RGC altípust katalogizáltak anatómiai és molekuláris markerek alapján (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), és a bizonyítékok szerint az embereknek körülbelül 20 vagy annál több egyedi kapcsolódású altípusuk van (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Elméletileg az őssejtprotokollok finomhangolhatók lennének specifikus altípusok előállítására a fejlődési jelek módosításával. A gyakorlatban a legtöbb jelenlegi módszer vegyes RGC populációt céloz meg. A kutatók ezután marker-kombinációkkal történő kettős festéssel ellenőrzik az altípusok sokféleségét: például egy humán RGC differenciálódási tanulmány azonosított jelölt on-off irányválogató RGC-ket (CART-ot expresszáló) és alfa-RGC-ket (SPP1/osteopontint expresszáló) a BRN3+ sejtjeikben (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Az altípus-specifikáció optimalizálása aktív kutatási terület, mivel minden RGC altípusnak (saját pre- és poszt-szinaptikus partnereivel) megfelelő integrációra lesz szüksége in vivo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Az RGC termelés hatékonysága és sebessége javult. A korai protokollok több hetet vagy hónapot vettek igénybe, de az újabb módszerek felgyorsítják a folyamatot. Például Luo és munkatársai a NGN2 transzkripciós faktor túlzott expresszióját és neurotróf közeget alkalmazva mindössze két hét alatt RGC-szerű neuronokat hoztak létre, szemben a korábbi 2D vagy 3D kultúrákban elért 1-2 hónapos időtartammal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ezek a sejtek RGC markereket expresszáltak, és felnőtt patkányszemekbe transzplantálva „sikeresen migráltak a ganglionsejtrétegbe 1 héten belül” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hasonlóképpen, a 3D retinális organoidokként (melyek utánozzák a szem fejlődését) tenyésztett pluripotens őssejtek természetesen termelnek RGC-ket más retinális neuronokkal együtt. Az organoidokból származó RGC-k génexpressziós profilja közelebb áll a magzati RGC-khez, mint a 2D kultúrákból származókéhoz, és sok csoport ma már RGC-ben gazdag sejteket gyűjt organoidokból transzplantációs kísérletekhez (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

E fejlődés ellenére a hozamok szerények maradnak, és a kultúrák heterogének. A protokollok gyakran vegyes retinális sejtek populációját hozzák létre, kisebbségben RGC-kkel, és a túlélés a kultúrában korlátozott lehet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A kutatók jellemzően sejtszétválasztást (pl. Thy1 vagy BRN3 riporterekkel) alkalmaznak az RGC-k tisztítására a transzplantáció előtt. Fő cél a nagyon magas tisztaság elérése, mivel bármely nem differenciált vagy nem célzott sejt daganatképződési kockázatot rejt magában. Egy friss tanulmány figyelmeztetett, hogy „a transzlációs tanulmányokhoz kritikus fontosságú lesz a donor RGC-k tisztaságának meghatározása a teratómaképződés kockázatának csökkentése érdekében” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Transzplantáció állatmodellekben: Túlélés és integráció

Számos preklinikai tanulmány tesztelte már a humán őssejtekből származó RGC-ket állatmodellekben. A célok között szerepel annak demonstrálása, hogy a transzplantált RGC-k túlélhetnek, integrálódhatnak a gazda retinájába, axonokat bocsáthatnak ki, és (végső soron) jeleket továbbíthatnak. A kísérleteket főként rágcsálókon (egerek, patkányok), de nagyobb állatokon (macskák) és nem emberi főemlősökön is végezték.

Miután in vitro differenciálták vagy izolálták az RGC-ket, a kutatók a gazda szemébe juttatják őket. Két fő stratégia az intravitreális injekció (sejtek befecskendezése az üvegtestbe, a szem belső üregébe) vagy a szubretinális beadás (sejtek elhelyezése a retina alá). Az eredmények változatosak:

- Intravitreális injekció technikailag egyszerű az RGC-k (melyek a retina belső felületén helyezkednek el) célzására. Több csoport fecskendezett humán RGC-k vagy retinális organoidokból származó RGC-k szuszpenzióját rágcsálók üvegtestébe. Például Vrathasha és munkatársai körülbelül 50 000 humán iPSC-RGC-t intravitreálisan injekcióztak WS egerekbe, és azt találták, hogy a transzplantált sejtek a ganglionsejtrétegben lokalizálódtak és a transzplantáció után legalább öt hónapig túléltek (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ezek a sejtek normális dendritikus arborizációt mutattak, és fény által kiváltott akciós potenciálokat generáltak, melyek szinte azonosak voltak a natív egér RGC-kkel (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), bizonyítva, hogy legalább a retinában funkcionálisan integrálódni tudnak. Luo és munkatársai (2020) hasonlóképpen kimutatták, hogy a hESC-ből származó RGC-szerű sejtek (NGN2-t túlzottan expresszálók) egy héten belül migráltak a felnőtt patkányok ganglionsejtrétegébe (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ezek az eredmények biztatóak, de az igazán integrálódó sejtek száma általában csekély. Vrathasha átlagosan ~672 túlélő donor sejtről számolt be egér retinánként (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) – ami a normális RGC számoknak csak egy apró töredéke –, rávilágítva a kihívásokkal teli környezetre.

Az egyszerű intravitreális szuszpenziók egyik problémája, hogy a sejtek gyakran összecsapódnak vagy nem tapadnak meg. RGC sérülés macska modelljében Becker és munkatársai megállapították, hogy az intravitreális sejtszuszpenzió injekciója sejtaggregációt és csekély valódi integrációt eredményezett (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Megjegyezték, hogy egy scaffold (váz) használata javíthatja a túlélést és a retinális migrációt. Valóban, néhány tanulmány ma már biomateriális scaffoldokra vagy organoid szövetekre ágyazza be az RGC-ket a támogatásuk érdekében. Például humán retinális organoidokat (melyekből RGC-ket gyűjtöttek a fejlődés 60-70. napján) szubretinálisan transzplantáltak macskaszemekbe. Szisztémás immunszuppresszióval ezek az organoid graftok legalább 1 hónapig túléltek, és úgy tűnt, szinaptikus kapcsolatokat alakítottak ki a gazda neuronjaival (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A szubretinális megközelítés biztosította a donor szövet és a retina közötti szoros érintkezést, míg az intravitreális sejtszuszpenziók hajlamosak voltak lebegni vagy összecsapódni. Másrészről, a szubretinális beadás bonyolultabb műtét, és korlátozhatja a rendelkezésre álló hely (a szubretinális tér vékony a négylábúakban és főemlősökben).

Kis rágcsálókban az intravitreális beadás marad a leggyakoribb megközelítés. Injekció után sikeres donor sejteket azonosítottak, melyek a gazda retinális ganglionsejtrétegébe vándoroltak, és RGC markereket (BRN3, RBPMS) expresszáltak heteken-hónapokon át (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Néhány tanulmány beszámol arról, hogy a donor sejtek új dendriteket és akár kezdeti axonnyúlványokat is növesztenek a látóidegfő felé. Például transzplantált hiPSC-RGC-k egerekben bonyolult dendritfákat mutattak, és (fénnyel stimulálva) posztszinaptikus potenciálokat generáltak, jelezve, hogy szinapszisokat képeztek bipoláris/amacrin interneuronokkal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Fontos azonban óvatosnak lenni: a fotoreceptor transzplantációkkal szerzett tapasztalatok azt mutatják, hogy az átvitt fluoreszcens markerek néha azt a látszatot kelthetik, mintha a transzplantált sejtek integrálódtak volna, amikor valójában csak festéket adtak át a gazdasejteknek (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Szigorú jelölés és funkcionális tesztelés szükséges a valódi integráció megerősítéséhez. Eddig minden esetben az injekciózott RGC-knek csak egy részhalmaza éli túl és integrálódik. Például Vrathasha és munkatársai 500 000 sejtet injekcióztak, de később csak ~0,13%-ukat (kb. 650 sejtet) találtak életben 5 hónap elteltével (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nyilvánvaló, hogy a gazda retinális környezete erős szelekciós nyomást gyakorol, és a túlélés továbbra is korlátozó tényező.

Beadási útvonalak: Intravitreális versus szubretinális

Az RGC-k szembe juttatásának módja gyakorlati és biológiai következményekkel jár. Az intravitreális injekciók a sejteket a szem gélszerű anyagába (üvegtest) helyezik a retina mellé. Ez az útvonal közvetlenül fürdeti a belső retinát, de a sejteket diffúziós kihívásoknak is kiteheti (a retinális felülethez kell tapadniuk az integrációhoz). Ahogy fentebb említettük, a támasztó nélküli sejtszuszpenziók összecsapódhatnak; a túlélés rossz lehet, hacsak a sejtek nem vándorolnak gyorsan a gazdaszövetbe. Számos tanulmány kimutatta, hogy a scaffold-on alapuló vagy organoid-alapú graftok (nem pedig egysejt-szuszpenziók) javítják az eredményeket (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Az intravitreális beadás előnye a viszonylag egyszerű technika (már használják gyógyszerinjekciókhoz és génterápiás vektorokhoz) és az RGC-k közvetlen célzása.

Ezzel szemben a szubretinális beadást (sejtek elhelyezése a retina és a retinális pigmenthám között) hagyományosan fotoreceptor vagy RPE transzplantációkhoz használják. RGC transzplantációk esetén kevésbé intuitív, de előnyös érintkezést biztosíthat. Singh és munkatársai macska-tanulmányában humán retinális organoidokat ültettek be szubretinálisan, szoros appozícióban a gazda retinájához. Az immunszuppresszió szükségessége ellenére ezek a graftok hetekig túléltek, és szinapszisképződés jeleit mutatták a retinális ganglionsejtekkel (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A szűk szubretinális tér a helyén tartotta a donor sejteket. Azonban macskákban és főemlősökben ez a tér rendkívül vékony, ami megnehezíti a célzást. A szubretinális műtét a gazda retina számára is nagyobb kockázatot jelent. Ezért az intravitreális injekció marad a standard megközelítés rágcsálókban, míg szubretinális vagy epiretinális (a retina felületére történő) stratégiák nagyobb szemekben is vizsgálhatók.

Összefoglalva, az intravitreális injekció a legkönnyebb, de gyakran scaffoldokat vagy nagy sejtszámot igényel a túléléshez (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A szubretinális graftok/klaszterek szoros érintkezést érhetnek el (mint a Singh macska-tanulmányában (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)), de sebészeti kihívásokat jelentenek. Mindkét útvonalat vizsgálják, és lehetséges, hogy a jövőbeli protokollok a sejtek biokompatibilis scaffoldokba vagy gélekbe való beágyazását kombinálják a donor-gazda interfészelés maximalizálása érdekében.

Az axonregeneráció és a konnektivitás akadályai

Még ha a transzplantált RGC-k túl is élnek és elhelyezkednek a szemben, jelentős akadályok gátolják, hogy látást továbbítsanak az agyba. Egy normális (felnőtt) központi idegrendszerben a sérült látóideg-rostok nem nőnek vissza jól. A transzplantált RGC-k ugyanazzal az ellenséges környezettel néznek szembe. A főbb akadályok közé tartoznak:

Axonnövekedés a Lamina Cribrosán keresztül

A lamina cribrosa egy szitaszerű struktúra a látóidegfőnél, ahol az RGC axonok kilépnek a szemből. Ez a visszanövés fő szűk keresztmetszete. Állatkísérletekben a kutatók azt találták, hogy kevés transzplantált RGC axon halad át ezen az akadályon. Egy alapos tanulmány arról számolt be, hogy „amikor RGC-ket injekcióztak az üvegtestbe, kevesen integrálódtak a retinába. Azon RGC-k közül, amelyek sikeresen integrálódtak a GCL-be, sok axon hajtott ki, amelyek a látóidegfő felé nőttek, de kevesen nőttek túl a lamina cribrosán (~10%)” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Más szóval, az új axonok 90%-a a lamina-nál megrekedt. A lamina sűrű gliális és extracelluláris mátrixot tartalmaz, amely valószínűleg gátló jeleket és fizikai akadályokat termel. Ennek az akadálynak a leküzdése megkövetelheti a donor axonok génmódosítását (például a pro-növekedési útvonalak, mint az mTOR vagy Wnt felfelé szabályozásával) vagy a lamina környezetének módosítását (például enzimek alkalmazásával vagy gátló molekulák semlegesítésével). Ez a probléma analóg bármely gerincvelő-sérüléssel: a központi idegrendszer axonregenerációs kudarcának tulajdonságával. Ez azt sugallja, hogy még ha RGC-ket helyezünk is a szembe, az axonjaik látóidegbe juttatásához nagyon erős pro-regeneratív stimulusokra lesz szükség.

Irányítás az agyi célpontokhoz

Feltételezve, hogy az RGC axonok ki tudnak lépni a szemből, a következő kihívás az axonok irányítása nagy távolságokon keresztül a megfelelő célpontokhoz (elsősorban a laterális geniculáris mag (LGN) a thalamusban és a felső ikertest a középagyban). A fejlődés során az RGC axonokat molekuláris gradiensek (pl. ephrin-A/EphA fehérjék) és spontán retinális aktivitás irányítja. A felnőtt agyak általában nélkülözik ezeket a jeleket. Néhány rágcsáló-tanulmány kimutatta, hogy lehetséges a regenerálódó RGC axonokat a felső ikertesthez való újrakapcsolódásra irányítani: például egy látóideg-pálya léziós modell felfelé szabályozta a pro-növekedési géneket (mTOR, JAK/STAT) és új szinapszisokat figyelt meg az ikertestben (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Azonban ezek a regenerált axonok nem állították helyre a látást, hacsak nem kaptak mesterséges támogatást (lásd a mielinizációt alább). Röviden, a megfelelő irányító jelek megtalálása (vagy biztosítása) nyitott kutatási kérdés. Az átültetett RGC axonok ideális esetben utánoznák az embrionális irányító jeleket, hogy kialakítsák a helyes retinotóp térképet az agyban, de továbbra sem világos, hogyan lehet ezt elérni felnőtteknél.

Szinapszisképződés

Az új axonoknak végső soron szinapszisokat kell képezniük a megfelelő célneuronokkal. Biztatóan, a bizonyítékok arra utalnak, hogy a transzplantált RGC-k képesek szinaptikus kapcsolatokat képezni legalább a retinán belül. Johnson és munkatársai tanulmányában a gazda GCL-jébe migrált hiPSC-ből származó RGC-k normális dendritikus arborizációt mutattak. Szinaptikus marker festéssel és fénystimulációval a szerzők „demonstrálták új és funkcionális szinapszisok kialakulását a donor RGC-k és a gazda retina között” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Más szóval, az átültetett RGC-k képesek voltak kapcsolódni a bipoláris/amacrin interneuronokkal és jeleket továbbítani downstream gazdasejteknek, bár a válaszok kissé gyengébbek voltak, mint a natív sejteké. Ez az eredmény azt jelzi, hogy legalább a belső retina szintjén megfelelő huzalozás alakulhat ki.

Az agyban a szinapszisképződést még nehezebb elérni és mérni. Néhány regenerációs tanulmány (nem önmagában transzplantációs tanulmány) arra ösztönözte az RGC axonokat, hogy visszanőjenek a colliculus felé és szinapszisokat képezzenek (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A fent említett látóideg-pálya léziós modellben a szuprachiazmatikus/collicularis régióban lévő új axonok képeztek szinapszisokat, de az egereknek továbbra sem volt mérhető vizuális viselkedésük. Ezt később a mielin hiányának (lásd következő szakasz) tulajdonították, nem pedig hibás szinapszisoknak (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lényeg: A szinaptogenezis elvileg lehetséges, de a látást helyreállító, robusztus, precízen célzott szinapszisok biztosítása nagy akadály. Valószínűleg „fejlődésszerű” jelekre lesz szükség, mint például mintázott fénystimuláció (retinális hullámok) vagy támogató glia sejtek együtt transzplantálása az új kapcsolatok irányításához és erősítéséhez.

Regenerált axonok mielinizációja

Végül az RGC axonok általában csak a lamina cribrosán való áthaladás után mielinizálódnak – ami a szem érdekes tervezési jellemzője. Az oligodendrocitákat (a központi idegrendszer mielinizáló sejtjeit) a lamina távol tartja a retinától (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Ha egy transzplantált RGC axonja kilép a szemből, belép a központi idegrendszerbe, amely mielinizáló gliát tartalmaz. Azonban számos kísérleti esetben az új axonok mielin nélküliek maradnak. Ez azért fontos, mert a mielin nélküli hosszú központi idegrendszeri axonok nagyon rosszul vezetik az impulzusokat. A látóideg-pálya regenerációs tanulmányában (fentebb leírva) a szerzők azt találták, hogy az újonnan képződött axonok mielin nélküliek voltak, és az egerek nem mutattak látásjavulást, kivéve, ha 4-aminopiridint (4-AP) kaptak – egy olyan gyógyszert, amely blokkolja a káliumcsatornákat és fokozza a vezetést a demielinizált rostokban (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Valójában a 4-AP részlegesen helyreállította a látást a mielin hiányának kompenzálásával. Ez az eredmény aláhúzza a lényeget: még ha egy RGC axon el is éri a célpontját, mielin nélkül nem fogja elég gyorsan vezetni a jeleket a látáshoz. A megfelelő mielinizáció biztosítása – talán oligodendrocita prekurzorok együtt transzplantálásával vagy a gazdaglia stimulálásával – kulcsfontosságú lesz.

Összefoglalva, a transzplantált RGC-k számos akadállyal néznek szembe: csak kevesen nőnek túl a lamina cribrosán (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), meg kell találniuk a megfelelő útvonalat az agyi célpontokhoz, megfelelő szinapszisokat kell képezniük, majd mielinbe kell burkolódniuk. Jelenleg minden lépés csak részleges sikert aratott állatmodellekben. Ezen akadályok leküzdése a neuroregeneráció aktív kutatási területe.

Immunológiai és biztonsági kihívások

A szem viszonylag immunprivilegizált, de a sejtek transzplantációja továbbra is immunológiai támadás kockázatával jár. Ha a donor sejtek autológok (a páciens saját iPSC-jeiből származnak), az elutasítás minimális, de a technikai komplexitás magas. Az allogén sejtek (más donortól vagy őssejt vonalból származók) könnyebben előállíthatók, de a gazda immunrendszere megtámadhatja őket. Állatkísérletekben a kutatók gyakran alkalmaznak immunszuppresszív gyógyszereket a graft túlélésének elősegítésére. Például a macska organoid transzplantációs tanulmányban szisztémás immunszuppresszióra volt szükség ahhoz, hogy a graft túléljen és kapcsolatokat képezzen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Immunszuppresszió nélkül a xenogén sejtek gyorsan kiürülnek. Érdekes módon a legtöbb retinális transzplantációs preklinikai tanulmány csak enyhe gyulladást, nem pedig teljes elutasítást jelent – ami a szem barrierjeinek előnye (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Azonban a hosszú távú siker valószínűleg átmeneti immunszuppressziót vagy fejlett technikákat (például a sejtek „álcázását” immunelkerülő bevonatokkal) igényel (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bármely jövőbeli emberi vizsgálatnak foglalkoznia kell ezzel, hogy a donor RGC-ket ne pusztítsák el a gazda T-sejtjei.

Kapcsolódó aggodalom a tumorigenitás. A pluripotens őssejtek teratómákat képezhetnek, ha nem differenciált sejteket transzplantálnak. Még kis számú szennyező PSC is katasztrofális lehet az RGC preparátumban. Ezért a kutatók a graftált populáció magas tisztaságát hangsúlyozzák. Vrathasha és munkatársai megjegyzik, hogy „kritikus fontosságú a donor RGC-k tisztaságának meghatározása a teratómaképződés kockázatának csökkentése érdekében” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ez alapos minőségellenőrzést igényel – például sejtek válogatását RGC-specifikus riporterekkel vagy áramlási citometriával, és genomi metilációs vagy génexpressziós vizsgálatokkal annak biztosítására, hogy ne maradjon pluripotens sejt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eddig nem jelentettek daganatokat a kisállat RGC transzplantációs kísérletekben, de a klinikai transzláció rendkívül szigorú tisztítást és kibocsátási tesztelést fog megkövetelni bármely őssejttermék esetében.

Kilátások: Glaukóma emberi vizsgálatai felé

Tekintettel a fenti félelmetes kihívásokra, mikor várható ésszerűen az RGC pótlás első klinikai vizsgálata glaukómás betegeknél? Sajnos a válasz valószínűleg „nem hamarosan”. A terület még korai preklinikai szakaszban van (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eddig egyetlen emberi vizsgálat sem regisztrált kifejezetten RGC transzplantációra glaukómában. A létező „őssejt klinikák” (például az autológ zsírszövet- vagy csontvelősejtek félrevezető vizsgálatai) ad hoc megközelítésekre fókuszáltak, és kirívóan károkat okoztak (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). A betegeknek óvakodniuk kell a nem bizonyított terápiáktól, amelyek megkerülik az FDA felügyeletét. A legitim, első emberi vizsgálatokhoz szilárd bizonyítékokra lenne szükség állatokon, amelyek minden akadályt kezelnek, valamint robusztus biztonsági adatokra. Ez sok évet vehet igénybe.

Pragmatikus kilátás, hogy kis biztonsági vizsgálatok indulhatnak a 2020-as évek végén vagy a 2030-as években, ha a fejlődés folytatódik. A jelöltek valószínűleg nagyon előrehaladott betegségben szenvedő (ahol a retina és a látóideg nagyrészt szétkapcsolódott lehet) betegek lennének, vagy éppen ellenkezőleg, közepesen súlyos betegségben szenvedők (az esetleges előnyök maximalizálása érdekében). Az elsődleges végpontok kezdetben a biztonság lennének: káros gyulladásos reakciók vagy daganatképződés hiánya a szemben. A másodlagos végpontok célja a graft „megtapadásának” bármilyen anatómiai vagy funkcionális jelének kimutatása lenne. Például a retina képalkotása (optikai koherencia tomográfia) kereshetné a retinális idegrostréteg vagy ganglionsejtréteg megvastagodását ott, ahol a sejteket injekciózták. Elektrofiziológiai tesztek, mint a mintázott elektroretinogram (PERG) vagy a vizuálisan kiváltott potenciálok (VEP), elektromos válaszokat mutathatnak ki a graftált sejtekből. Végső soron a funkcionális látásvizsgálatok (például látómezők vagy kontrasztérzékenység) fontosak lennének, de már egy apró látóív helyreállításának bemutatása is úttörő lenne. Analóg módon, az örökletes retinális betegségek génterápiás vizsgálatai strukturális vs. funkcionális kategóriákban mérik az eredményeket (pmc.ncbi.nlm.nih.gov); hasonló kategóriák (OCT anatómia, elektrofiziológia, vizuális funkció, beteg által jelentett látás) lennének alkalmazhatók.

Összefoglalva, bár óvatos optimizmus van, bármilyen gyakorlati időkeret hosszú. A fent vázolt lépések mindegyike finomításra szorul. Egy reális első vizsgálatot a 2030-as évek közepén vagy végén tervezhetnek, az axonregeneráció és a biztonsági profilok áttöréseitől függően. A jelölteket és végpontokat gondosan választanák ki: valószínűleg először biztonsági végpontokat, majd az integráció szurrogátumait (képalkotás, elektrofiziológia), mielőtt mérhető látásjavulásra számítanánk. Más szóval, a területnek egyensúlyoznia kell a reményt a realizmussal – az RGC pótlása kutatási maraton lesz, nem pedig gyors sprint.

Következtetés

Az elveszett RGC-k pótlása glaukómában laboratóriumban növesztett megfelelőikkel izgalmas, de még csak kialakulóban lévő ötlet. In vitro a humán pluripotens őssejtek RGC-szerű sejtekké alakíthatók, amelyek kulcsfontosságú markereket és még bizonyos altípus-jellemzőket is expresszálnak (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Állatokon végzett transzplantációs tanulmányok kimutatták, hogy ezen sejtek egy része hónapokig túlélhet, integrálódhat a retinális áramkörbe, és potenciálisan szinapszisokat képezhet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Azonban hatalmas akadályok maradnak. Az axon növekedése a lamina cribrosán túl gyenge (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), a központi célpontokhoz való irányítás elégtelenül kontrollált, a szinapszisok gyengék vagy hiányoznak, és az axonoknak nincs mielinjük (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Ezen felül az immunelutasítást és a daganatkockázatot is kezelni kell. Egyelőre a kutatók sorra veszik fel a harcot minden kihívással. Amíg megbízhatóan nem tudunk őssejtből származó RGC-ket növeszteni, bejuttatni és összekötni, a látást helyreállító transzplantációk a laboratóriumban maradnak. De az állandó fejlődés reményt ad: folyamatos innovációval és óvatossággal a „petri-csészétől a látóideg-pályáig” tartó RGC-pótlás álma egy napon kísérletből gyógyításra válthat.