परिचय

ग्लूकोमा दुनिया भर में अपरिवर्तनीय अंधत्व का एक प्रमुख कारण है क्योंकि रेटिनल गैन्ग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी) जो आंख को मस्तिष्क से जोड़ती हैं, मर जाती हैं और पुनर्जीवित नहीं हो सकतीं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। आरजीसी के बिना, रेटिना से दृश्य संकेत मस्तिष्क केंद्रों (जैसे लेटरल जेनिकुलेट न्यूक्लियस और सुपीरियर कोलिकुलस) तक नहीं पहुंच सकते, जिससे दृष्टि चली जाती है। ग्लूकोमा के वर्तमान उपचार (उदाहरण के लिए, अंतःनेत्र दबाव कम करना) बची हुई आरजीसी की रक्षा कर सकते हैं, लेकिन पहले से नष्ट हो चुकी कोशिकाओं को पुनर्स्थापित नहीं कर सकते (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। स्टेम-सेल थेरेपी का लक्ष्य मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (या तो भ्रूणीय स्टेम कोशिकाएं, ईएससीएस, या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं, आई-पीएससी) को आरजीसी में विभेदित करके और उन्हें आंख में प्रत्यारोपित करके खोई हुई आरजीसी को बदलना है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। सिद्धांत रूप में, यह रेटिनल न्यूरॉन्स का एक असीमित स्रोत प्रदान कर सकता है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। लेकिन इस परिकल्पना को साकार करने के लिए भारी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है: नई आरजीसी को जीवित रहना चाहिए, आंख के निकास (लैमना क्रिब्रोसा) के माध्यम से ऑप्टिक तंत्रिका में एक्सॉन विकसित करना चाहिए, सटीक मस्तिष्क लक्ष्यों तक लंबी दूरी तय करनी चाहिए, कार्यात्मक सिनैप्स बनाने चाहिए, और मायेलिनेटेड होना चाहिए – ये सब वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अवरोधक वातावरण में।

यह लेख मानव स्टेम कोशिकाओं से आरजीसी प्राप्त करने और उन्हें पशु मॉडल में प्रत्यारोपित करने की वर्तमान स्थिति की समीक्षा करता है। फिर हम सफलता की महत्वपूर्ण बाधाओं पर चर्चा करते हैं – लैमना क्रिब्रोसा के माध्यम से एक्सॉन का विस्तार, थैलेमिक और कोलिकुलर लक्ष्यों तक मार्गदर्शन, सिनैप्स का निर्माण, और मायेलिनेशन – साथ ही सुरक्षा के मुद्दे (प्रतिरक्षा अस्वीकृति, ट्यूमर का जोखिम) और वितरण के तरीके (इंट्राविट्रियल बनाम सबरेटिनल इंजेक्शन)। अंत में, हम एक यथार्थवादी दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं कि ग्लूकोमा में “फर्स्ट-इन-ह्यूमन” परीक्षण कब संभव हो सकते हैं और उन्हें किन परिणाम मापों की आवश्यकता होगी। पूरे लेख में, हम स्पष्टता के लिए प्रयास करते हैं: मुख्य शब्दों को बोल्ड रखा गया है और किसी भी तकनीकी अवधारणा को सामान्य दर्शकों के लिए समझाया गया है।

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से आरजीसी का विभेदन

वैज्ञानिकों ने मानव ईएससीएस या आई-पीएससी को आरजीसी-जैसे न्यूरॉन्स में बदलने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। आम तौर पर, स्टेम कोशिकाओं को पहले वृद्धि कारकों और छोटे अणुओं के संयोजन का उपयोग करके रेटिनल पूर्वज अवस्था में निर्देशित किया जाता है जो आंख के विकास की नकल करते हैं (उदाहरण के लिए, एफजीएफ, आईजीएफ, बीएमपी, डब्ल्यूएनटी और नॉच पाथवे मॉड्यूलेटर) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। सही परिस्थितियों में ये कोशिकाएं आगे आरजीसी में विभेदित हो जाएंगी, जिसकी पुष्टि आरजीसी मार्करों द्वारा की जा सकती है। प्रमुख मार्करों में प्रतिलेखन कारक BRN3B (POU4F2) और ISL1, आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन RBPMS, न्यूरोनल साइटोस्केलेटल प्रोटीन β-III ट्यूबलिन (TUJ1), और सिन्यूक्लिन-γ (SNCG) शामिल हैं। वास्तव में, एक अध्ययन से पता चला है कि PSC-व्युत्पन्न संस्कृतियों में कई आरजीसी मार्कर व्यक्त होते हैं: “BRN3, ISL1, और SNCG जैसे प्रतिलेखन कारक” लंबे न्यूराइट्स के साथ दिखाई दिए, जो एक आरजीसी पहचान की पुष्टि करते हैं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। ये स्टेम-सेल आरजीसी जीन अभिव्यक्ति और आकारिकी में अपने प्राकृतिक समकक्षों से मिलते जुलते हैं, लंबे प्रक्रमों का विस्तार करते हैं और एक्शन पोटेंशियल्स को फायर करते हैं।

आरजीसी एक समान कोशिका प्रकार नहीं हैं। दर्जनों आरजीसी उपप्रकार मौजूद हैं (जैसे गति-संवेदनशील दिशा-चयनात्मक कोशिकाएं, ऑन/ऑफ केंद्र कोशिकाएं, आंतरिक रूप से प्रकाश-संवेदनशील मेलानोप्सिन कोशिकाएं, अल्फा-आरजीसी, आदि), प्रत्येक के विशिष्ट कार्य होते हैं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। पशु अध्ययनों ने शरीर रचना और आणविक मार्करों द्वारा 30+ आरजीसी उपप्रकारों को सूचीबद्ध किया है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), और साक्ष्य बताते हैं कि मनुष्यों में 20 या अधिक उपप्रकार होते हैं जिनकी अद्वितीय कनेक्टिविटी होती है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। सिद्धांत रूप में, स्टेम-सेल प्रोटोकॉल को विकास संबंधी संकेतों को समायोजित करके विशिष्ट उपप्रकार उत्पन्न करने के लिए ट्यून किया जा सकता है। व्यवहार में, अधिकांश वर्तमान तरीके मिश्रित आरजीसी आबादी का लक्ष्य रखते हैं। शोधकर्ता फिर मार्कर संयोजनों के लिए सह-अभिरंजन करके उपप्रकार विविधता को सत्यापित करते हैं: उदाहरण के लिए, एक मानव आरजीसी विभेदन अध्ययन ने अपनी BRN3+ कोशिकाओं के भीतर उम्मीदवार ऑन-ऑफ दिशा-चयनात्मक आरजीसी (CART व्यक्त करने वाले) और अल्फा-आरजीसी (SPP1/ऑस्टियोपोंटिन व्यक्त करने वाले) की पहचान की (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। उपप्रकार विशिष्टता का अनुकूलन एक सक्रिय शोध क्षेत्र है, क्योंकि प्रत्येक आरजीसी उपप्रकार (अपने स्वयं के प्री- और *पोस्ट-*सिनैप्टिक भागीदारों के साथ) को इन विवो में उचित एकीकरण की आवश्यकता होगी (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)।

आरजीसी उत्पादन की दक्षता और गति में सुधार हुआ है। शुरुआती प्रोटोकॉल में कई सप्ताह या महीने लगते थे, लेकिन नए तरीके प्रक्रिया को तेज करते हैं। उदाहरण के लिए, लुओ एट अल। ने प्रतिलेखन कारक एनजीएन2 के अत्यधिक अभिव्यक्ति और एक न्यूरोट्रॉफिक माध्यम को इंजीनियर करके केवल दो सप्ताह में आरजीसी-जैसे न्यूरॉन्स का उत्पादन किया, जबकि पहले के 2डी या 3डी संस्कृतियों में 1-2 महीने लगते थे (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। इन कोशिकाओं ने आरजीसी मार्कर व्यक्त किए और, जब वयस्क चूहों की आंखों में प्रत्यारोपित किया गया, तो “1 सप्ताह में गैन्ग्लियन कोशिका परत में सफलतापूर्वक पलायन किया” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। इसी तरह, 3डी रेटिनल ऑर्गेनोइड्स (जो आंख के विकास को दोहराते हैं) के रूप में उगाए गए प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं स्वाभाविक रूप से अन्य रेटिनल न्यूरॉन्स के साथ आरजीसी का उत्पादन करती हैं। ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न आरजीसी में 2डी संस्कृतियों की तुलना में भ्रूण आरजीसी के करीब जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल होते हैं, और कई समूह अब प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए ऑर्गेनोइड्स से आरजीसी-समृद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करते हैं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)।

इस प्रगति के बावजूद, उपज मामूली रहती है और संस्कृतियां विषम होती हैं। प्रोटोकॉल अक्सर आरजीसी की एक अल्पसंख्यक के साथ एक मिश्रित रेटिनल कोशिका आबादी का उत्पादन करते हैं, और संस्कृति में जीवित रहना सीमित हो सकता है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। शोधकर्ता आमतौर पर प्रत्यारोपण से पहले आरजीसी को शुद्ध करने के लिए सेल सॉर्टिंग (जैसे Thy1 या BRN3 रिपोर्टर्स) का उपयोग करते हैं। एक प्रमुख लक्ष्य बहुत उच्च शुद्धता प्राप्त करना है, क्योंकि कोई भी अविभेदित या ऑफ-टारगेट कोशिकाएं ट्यूमर बनने का जोखिम उठाती हैं। एक हालिया अध्ययन ने चेतावनी दी है कि “अनुवादात्मक अध्ययनों के लिए टेराटोमा गठन के जोखिम को कम करने के लिए दाता आरजीसी की शुद्धता निर्धारित करना महत्वपूर्ण होगा” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)।

पशु मॉडल में प्रत्यारोपण: उत्तरजीविता और एकीकरण

कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने अब पशु मॉडल में मानव स्टेम-सेल–व्युत्पन्न आरजीसी का परीक्षण किया है। लक्ष्यों में यह प्रदर्शित करना शामिल है कि प्रत्यारोपित आरजीसी जीवित रह सकते हैं, मेजबान रेटिना में एकीकृत हो सकते हैं, एक्सॉन भेज सकते हैं, और (अंततः) संकेत प्रसारित कर सकते हैं। प्रयोग ज्यादातर कृन्तकों (चूहों, चूहों) में किए गए हैं, लेकिन बड़े जानवरों (बिल्लियों) और गैर-मानव प्राइमेट्स में भी।

विट्रो में आरजीसी को विभेदित या अलग करने के बाद, शोधकर्ता उन्हें मेजबान की आंख में पहुंचाते हैं। दो मुख्य रणनीतियाँ हैं इंट्राविट्रियल इंजेक्शन (कोशिकाओं को आंख की आंतरिक गुहा, विट्रियस में इंजेक्शन देना) या सबरेटिनल डिलीवरी (कोशिकाओं को रेटिना के नीचे रखना)। परिणाम भिन्न होते हैं:

• इंट्राविट्रियल इंजेक्शन आरजीसी (जो आंतरिक रेटिनल सतह पर रहते हैं) को लक्षित करने के लिए तकनीकी रूप से सीधा है। कई समूहों ने मानव आरजीसी या रेटिनल ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न आरजीसी का सस्पेंशन कृंतक विट्रियस में इंजेक्शन किया है। उदाहरण के लिए, व्राथाशा एट अल। ने लगभग 50,000 मानव iPSC-RGC को इंट्राविट्रियली WS चूहों में इंजेक्शन दिया और पाया कि प्रत्यारोपित कोशिकाएं गैन्ग्लियन कोशिका परत के भीतर स्थानीयकृत हो गईं और प्रत्यारोपण के बाद कम से कम पांच महीने तक जीवित रहीं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। इन कोशिकाओं ने सामान्य डेंड्रिटिक आर्बर्स विकसित किए और देशी माउस आरजीसी के लगभग समान प्रकाश-चालित एक्शन पोटेंशियल्स उत्पन्न किए (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), यह साबित करते हुए कि वे कम से कम रेटिना में कार्यात्मक रूप से एकीकृत हो सकते हैं। लुओ एट अल। (2020) ने इसी तरह दिखाया कि hESC-व्युत्पन्न आरजीसी-जैसी कोशिकाएं (NGN2 का अत्यधिक अभिव्यक्ति करती हुई) एक सप्ताह के भीतर वयस्क चूहों की गैन्ग्लियन परत में पलायन कर गईं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। ये परिणाम उत्साहजनक हैं, लेकिन वास्तव में एकीकृत होने वाली कोशिकाओं की संख्या आमतौर पर कम होती है। व्राथाशा ने प्रति माउस रेटिना में औसतन ~672 जीवित दाता कोशिकाओं की सूचना दी (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) – सामान्य आरजीसी संख्याओं का एक छोटा सा अंश – जो चुनौतीपूर्ण वातावरण को उजागर करता है।

  साधारण इंट्राविट्रियल सस्पेंशन के साथ एक समस्या यह है कि कोशिकाएं अक्सर गुच्छे बनाती हैं या चिपकने में विफल रहती हैं। आरजीसी चोट के एक बिल्ली मॉडल में, बेकर एट अल। ने पाया कि इंट्राविट्रियल कोशिका सस्पेंशन का इंजेक्शन कोशिका एकत्रीकरण और बहुत कम वास्तविक एकीकरण का कारण बना (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। उन्होंने उल्लेख किया कि एक स्कैफोल्ड का उपयोग अस्तित्व और रेटिनल प्रवासन में सुधार कर सकता है। वास्तव में, कुछ अध्ययन अब आरजीसी को बायोमैटेरियल स्कैफोल्ड्स या ऑर्गेनोइड ऊतक पर उन्हें सहारा देने के लिए एम्बेड करते हैं। उदाहरण के लिए, मानव रेटिनल ऑर्गेनोइड्स (विकास के दिन 60-70 पर आरजीसी का संग्रह) को बिल्ली की आंखों में सबरेटिनली प्रत्यारोपित किया गया था। प्रणालीगत इम्यूनोसप्रेसिव के साथ, ये ऑर्गेनोइड ग्राफ्ट कम से कम 1 महीने तक जीवित रहे और मेजबान न्यूरॉन्स के साथ सिनैप्टिक संपर्क बनाने लगे (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। सबरेटिनल दृष्टिकोण ने दाता ऊतक और रेटिना के बीच दृढ़ संपर्क सुनिश्चित किया, जबकि इंट्राविट्रियल सेल सस्पेंशन तैरने या गुच्छे बनाने की प्रवृत्ति रखते थे। दूसरी ओर, सबरेटिनल डिलीवरी एक अधिक जटिल सर्जरी है और उपलब्ध स्थान द्वारा सीमित हो सकती है (क्वाड्रुपेड्स और प्राइमेट्स में सबरेटिनल स्थान पतला होता है)।

छोटे कृन्तकों में, इंट्राविट्रियल डिलीवरी सबसे आम दृष्टिकोण बनी हुई है। इंजेक्शन के बाद, सफल दाता कोशिकाओं की पहचान मेजबान रेटिनल गैन्ग्लियन कोशिका परत में पलायन करते हुए और हफ्तों से महीनों तक आरजीसी मार्कर (BRN3, RBPMS) व्यक्त करते हुए की गई है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। कुछ अध्ययनों में दाता कोशिकाओं द्वारा नए डेंड्राइट्स का विस्तार और यहां तक कि ऑप्टिक तंत्रिका शीर्ष की ओर प्रारंभिक एक्सॉन स्प्राउट्स की रिपोर्ट दी गई है। उदाहरण के लिए, चूहों में प्रत्यारोपित hiPSC-RGCs ने विस्तृत डेंड्रिटिक पेड़ दिखाए और (जब प्रकाश से उत्तेजित किया गया) तो पोस्टसिनैप्टिक पोटेंशियल्स उत्पन्न किए, यह दर्शाता है कि उन्होंने बाइपोलर/अमैक्राइन इंटरन्यूरॉन्स के साथ सिनैप्स बनाए थे (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। हालांकि, सावधानी बरतना महत्वपूर्ण है: फोटोरिसेप्टर प्रत्यारोपण के अनुभवों से पता चलता है कि स्थानांतरित फ्लोरोसेंट मार्कर कभी-कभी यह दिखा सकते हैं कि प्रत्यारोपण कोशिकाएं एकीकृत हो गई हैं, जबकि वास्तव में उन्होंने केवल डाई को मेजबान कोशिकाओं में पारित किया था (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। सच्ची एकीकरण की पुष्टि के लिए कठोर लेबलिंग और कार्यात्मक परीक्षण की आवश्यकता है। अब तक के सभी मामलों में, केवल इंजेक्शन किए गए आरजीसी का एक उपसमूह ही जीवित रहता है और एकीकृत होता है। उदाहरण के लिए, व्राथाशा एट अल। ने 500,000 कोशिकाएं इंजेक्शन कीं, लेकिन बाद में 5 महीने में केवल ~0.13% (लगभग 650 कोशिकाएं) को जीवित पाया (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। स्पष्ट रूप से, मेजबान रेटिनल वातावरण मजबूत चयनात्मक दबाव डालता है, और अस्तित्व एक सीमित कारक बना हुआ है।

वितरण मार्ग: इंट्राविट्रियल बनाम सबरेटिनल

आरजीसी को आंख में कैसे पहुंचाना है, इसका चुनाव व्यावहारिक और जैविक निहितार्थ रखता है। इंट्राविट्रियल इंजेक्शन कोशिकाओं को आंख के जेल (विट्रियस) में रेटिना के बगल में रखते हैं। यह मार्ग सीधे आंतरिक रेटिना को स्नान कराता है, लेकिन कोशिकाओं को विसरित चुनौतियों के संपर्क में भी ला सकता है (उन्हें एकीकृत होने के लिए रेटिनल सतह से चिपकना चाहिए)। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, बिना समर्थन के कोशिका सस्पेंशन गुच्छे बना सकते हैं; अस्तित्व खराब हो सकता है जब तक कि कोशिकाएं जल्दी से मेजबान ऊतक में पलायन न करें। कई अध्ययनों में पाया गया है कि स्कैफोल्डेड या ऑर्गेनोइड-आधारित ग्राफ्ट्स (सिंगल-सेल सस्पेंशन के बजाय) परिणामों में सुधार करते हैं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। इंट्राविट्रियल डिलीवरी का लाभ यह है कि यह अपेक्षाकृत सरल तकनीक है (इसका उपयोग पहले से ही दवा इंजेक्शन और जीन थेरेपी वैक्टर के लिए किया जाता है) और आरजीसी का सीधा लक्ष्यीकरण।

इसके विपरीत, सबरेटिनल डिलीवरी (कोशिकाओं को रेटिना और रेटिनल पिगमेंट एपिथेलियम के बीच रखना) का उपयोग पारंपरिक रूप से फोटोरिसेप्टर या आरपीई प्रत्यारोपण के लिए किया जाता है। आरजीसी प्रत्यारोपण के लिए यह कम सहज है लेकिन लाभप्रद संपर्क प्रदान कर सकता है। सिंह एट अल. द्वारा किए गए बिल्ली के अध्ययन में, मानव रेटिनल ऑर्गेनोइड्स को मेजबान रेटिना के करीब सन्निकटता के साथ सबरेटिनली प्रत्यारोपित किया गया था। इम्यूनोसप्रेसिव की आवश्यकता के बावजूद, ये ग्राफ्ट हफ्तों तक जीवित रहे और रेटिनल गैन्ग्लियन कोशिकाओं के साथ सिनैप्स गठन के संकेत दिखाए (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। संकीर्ण सबरेटिनल स्थान ने दाता कोशिकाओं को जगह पर रखा। हालांकि, बिल्लियों और प्राइमेट्स में यह स्थान बहुत पतला होता है, जिससे लक्ष्यीकरण चुनौतीपूर्ण हो जाता है। सबरेटिनल सर्जरी में मेजबान रेटिना को भी अधिक जोखिम होता है। इस प्रकार, कृन्तकों में इंट्राविट्रियल इंजेक्शन मानक दृष्टिकोण बना हुआ है, जबकि बड़े आँखों में सबरेटिनल या एपिरेटिनल (रेटिनल सतह पर) रणनीतियों का पता लगाया जा सकता है।

संक्षेप में, इंट्राविट्रियल इंजेक्शन सबसे आसान है लेकिन किसी भी अस्तित्व के लिए अक्सर स्कैफोल्ड्स या उच्च कोशिका संख्या की आवश्यकता होती है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। सबरेटिनल ग्राफ्ट्स/क्लस्टर दृढ़ संपर्क प्राप्त कर सकते हैं (जैसा कि सिंह बिल्ली अध्ययन में (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)) लेकिन सर्जिकल चुनौतियां पेश करते हैं। दोनों मार्गों की जांच की जा रही है, और यह संभव है कि भविष्य के प्रोटोकॉल दाता-मेजबान इंटरफेसिंग को अधिकतम करने के लिए बायोकोम्पैटिबल स्कैफोल्ड्स या जैल में कोशिका एम्बेडिंग को संयोजित करेंगे।

एक्सॉन पुनर्जनन और कनेक्टिविटी के लिए बाधाएं

भले ही प्रत्यारोपित आरजीसी आंख में जीवित रहें और खुद को स्थापित करें, फिर भी प्रमुख बाधाएं मस्तिष्क तक दृष्टि को प्रसारित करने की उनकी क्षमता को रोकती हैं। एक सामान्य (वयस्क) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, क्षतिग्रस्त ऑप्टिक तंत्रिका फाइबर अच्छी तरह से पुनर्जीवित नहीं होते हैं। प्रत्यारोपित आरजीसी को उसी प्रतिकूल वातावरण का सामना करना पड़ता है। प्रमुख बाधाओं में शामिल हैं:

लैमना क्रिब्रोसा के माध्यम से एक्सॉन का विकास

लैमना क्रिब्रोसा ऑप्टिक तंत्रिका शीर्ष पर एक छलनी जैसी संरचना है जहां से आरजीसी एक्सॉन आंख से बाहर निकलते हैं। यह पुनर्जनन के लिए एक प्रमुख रुकावट बिंदु है। पशु प्रयोगों में, शोधकर्ता पाते हैं कि कुछ प्रत्यारोपित आरजीसी एक्सॉन ही इस बाधा को पार करते हैं। एक सावधानीपूर्वक अध्ययन में बताया गया है कि “जब आरजीसी को विट्रियस में इंजेक्शन दिया गया, तो कुछ ही रेटिना में एकीकृत हुए। जो आरजीसी सफलतापूर्वक जीसीएल में एकीकृत हुए, उनमें से कई ने एक्सॉन अंकुरित किए जो ऑप्टिक तंत्रिका शीर्ष की ओर बढ़े लेकिन कुछ ही लैमना क्रिब्रोसा (~10%) को पार कर पाए” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। दूसरे शब्दों में, 90% नए एक्सॉन लैमना पर रुक गए। लैमना में घने ग्लियल और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स होते हैं जो संभवतः अवरोधक संकेत और भौतिक बाधाएं उत्पन्न करते हैं। इस बाधा को दूर करने के लिए या तो दाता एक्सॉन को इंजीनियर करने की आवश्यकता हो सकती है (उदाहरण के लिए, एमटीओआर या डब्ल्यूएनटी जैसे प्रो-ग्रोथ पाथवे को विनियमित करके) या लैमना वातावरण को संशोधित करने की (उदाहरण के लिए, एंजाइमों को लागू करना या अवरोधक अणुओं को बेअसर करना)। यह समस्या किसी भी रीढ़ की हड्डी की चोट के समान है: एक्सॉन पुनर्जनन विफलता की सीएनएस संपत्ति। यह बताता है कि भले ही हम आरजीसी को आंख में रखें, उनके एक्सॉन को ऑप्टिक तंत्रिका में लाने के लिए बहुत मजबूत प्रो-पुनर्योजी उत्तेजनाओं की आवश्यकता होगी।

मस्तिष्क लक्ष्यों के लिए मार्गदर्शन

यह मानते हुए कि आरजीसी एक्सॉन आंख से बाहर निकल सकते हैं, अगली चुनौती सही लक्ष्यों (मुख्य रूप से थैलेमस में लेटरल जेनिकुलेट न्यूक्लियस (एलजीएन) और मिडब्रेन में सुपीरियर कोलिकुलस) तक लंबी दूरी पर एक्सॉन मार्गदर्शन है। विकास के दौरान, आरजीसी एक्सॉन को आणविक प्रवणता (जैसे एफ्रिन-ए/एफेए प्रोटीन) और सहज रेटिनल गतिविधि द्वारा निर्देशित किया जाता है। वयस्क मस्तिष्क में आमतौर पर इन संकेतों की कमी होती है। कुछ कृंतक अध्ययनों से पता चला है कि पुनर्जीवित आरजीसी एक्सॉन को सुपीरियर कोलिकुलस से फिर से जोड़ने के लिए निर्देशित करना संभव है: उदाहरण के लिए, एक ऑप्टिक ट्रैक्ट घाव मॉडल ने प्रो-ग्रोथ जीन (एमटीओआर, जेएके/स्टेट) को विनियमित किया और कोलिकुलस में नए सिनैप्स देखे (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। हालांकि, इन पुनर्जीवित एक्सॉन ने तब तक दृष्टि बहाल नहीं की जब तक कि उन्हें कृत्रिम रूप से सहारा नहीं दिया गया (नीचे मायेलिनेशन देखें)। संक्षेप में, सही मार्गदर्शन संकेतों को ढूंढना (या उन्हें प्रदान करना) एक खुला शोध प्रश्न है। प्रत्यारोपित आरजीसी एक्सॉन आदर्श रूप से मस्तिष्क में सही रेटिनोटोपिक मानचित्र बनाने के लिए भ्रूणीय मार्गदर्शन संकेतों को दोहराएंगे, लेकिन यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि वयस्कों में इसे कैसे प्राप्त किया जाए।

सिनैप्स का निर्माण

नए एक्सॉन को अंततः सही लक्ष्य न्यूरॉन्स के साथ सिनैप्स बनाने चाहिए। उत्साहजनक रूप से, साक्ष्य बताते हैं कि प्रत्यारोपित आरजीसी कम से कम रेटिना के भीतर सिनैप्टिक कनेक्शन बना सकते हैं। जॉनसन एट अल. द्वारा किए गए अध्ययन में, hiPSC-व्युत्पन्न आरजीसी जो मेजबान जीसीएल में पलायन कर गए थे, उन्होंने सामान्य डेंड्रिटिक आर्बर्स विकसित किए। सिनैप्टिक-मार्कर स्टेनिंग और प्रकाश उत्तेजना का उपयोग करते हुए, लेखकों ने “दाता आरजीसी और मेजबान रेटिना के बीच उपन्यास और कार्यात्मक सिनैप्स के गठन का प्रदर्शन किया” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। दूसरे शब्दों में, प्रत्यारोपित आरजीसी बाइपोलर/अमैक्राइन इंटरन्यूरॉन्स से जुड़ने और डाउनस्ट्रीम मेजबान कोशिकाओं को संकेत प्रसारित करने में सक्षम थे, हालांकि प्रतिक्रियाएं देशी कोशिकाओं की तुलना में कुछ कमजोर थीं। यह खोज इंगित करती है कि, कम से कम आंतरिक रेटिना के स्तर पर, उचित वायरिंग हो सकती है।

मस्तिष्क में सिनैप्स का निर्माण प्राप्त करना और मापना और भी कठिन है। कुछ पुनर्जनन अध्ययनों (स्वयं प्रत्यारोपण अध्ययन नहीं) ने आरजीसी एक्सॉन को कोलिकुलस की ओर फिर से उगने और सिनैप्स बनाने के लिए प्रेरित किया है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। ऊपर उल्लिखित ऑप्टिक ट्रैक्ट घाव मॉडल में, सुप्रैचियास्मैटिक/कोलिकुलर क्षेत्र में नए एक्सॉन ने सिनैप्स बनाए, लेकिन चूहों में अभी भी कोई मापने योग्य दृश्य व्यवहार नहीं था। इसका श्रेय बाद में दोषपूर्ण सिनैप्स के बजाय माइलिन की कमी को दिया गया (अगला खंड देखें) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। निचला रेखा: सिद्धांत रूप में सिनैप्टोजेनेसिस संभव है, लेकिन मजबूत, सटीक लक्षित सिनैप्स सुनिश्चित करना जो दृष्टि बहाल करते हैं, एक बड़ी बाधा है। इसमें संभवतः “विकास-जैसे” संकेतों की आवश्यकता होगी, जैसे कि पैटर्न वाली प्रकाश उत्तेजना (रेटिनल तरंगें) या सहायक ग्लिया का सह-प्रत्यारोपण, नए कनेक्शनों को निर्देशित और मजबूत करने के लिए।

पुनर्जीवित एक्सॉन का मायेलिनेशन

अंत में, आरजीसी एक्सॉन सामान्य रूप से लैमना क्रिब्रोसा से गुजरने के बाद ही मायेलिनेटेड होते हैं – यह आंख की एक दिलचस्प डिजाइन विशेषता है। ओलिगोडेंड्रोसाइट्स (सीएनएस मायेलिनेटिंग कोशिकाएं) को लैमना द्वारा रेटिना से बाहर रखा जाता है (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)। यदि एक प्रत्यारोपित आरजीसी का एक्सॉन आंख से बाहर निकलता है, तो यह सीएनएस में प्रवेश करता है, जिसमें मायेलिनेटिंग ग्लिया होती है। हालांकि, कई प्रायोगिक मामलों में नए एक्सॉन अनमायेलिनेटेड रहते हैं। यह मायने रखता है क्योंकि अनमायेलिनेटेड लंबे सीएनएस एक्सॉन आवेगों को बहुत खराब तरीके से संचालित करते हैं। ऑप्टिक ट्रैक्ट पुनर्जनन अध्ययन (ऊपर वर्णित) में, लेखकों ने पाया कि नवगठित एक्सॉन अनमायेलिनेटेड थे, और चूहों ने कोई दृश्य सुधार नहीं दिखाया जब तक कि उन्हें 4-एमिनोपाइरिडीन (4-एपी) नहीं दिया गया – एक दवा जो पोटेशियम चैनलों को अवरुद्ध करती है और डिमायेलिनेटेड फाइबर में चालन को बढ़ावा देती है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। प्रभाव में, 4-एपी ने मायलिन की कमी की भरपाई करके आंशिक रूप से दृष्टि बहाल की। यह परिणाम इस बात पर जोर देता है: भले ही एक आरजीसी एक्सॉन अपने लक्ष्य तक पहुंच जाए, माइलिन के बिना यह दृष्टि के लिए पर्याप्त तेजी से संकेत संचालित नहीं करेगा। उचित मायेलिनेशन सुनिश्चित करना – शायद ओलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूतों के सह-प्रत्यारोपण या मेजबान ग्लिया को उत्तेजित करके – महत्वपूर्ण होगा।

संक्षेप में, प्रत्यारोपित आरजीसी को एक चुनौती का सामना करना पड़ता है: केवल कुछ ही लैमना क्रिब्रोसा (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) को पार करते हैं, उन्हें मस्तिष्क के लक्ष्यों तक सही गलियारा खोजना होगा, उचित सिनैप्स बनाने होंगे, और फिर माइलिन में लपेटे जाने होंगे। प्रत्येक चरण में वर्तमान में पशु मॉडल में केवल आंशिक सफलता मिली है। इन बाधाओं को दूर करना न्यूरो-पुनर्जनन में अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है।

प्रतिरक्षा और सुरक्षा चुनौतियां

आंख अपेक्षाकृत प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त है, लेकिन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण में अभी भी प्रतिरक्षा हमले का जोखिम होता है। यदि दाता कोशिकाएं ऑटोलॉगस (एक रोगी की अपनी iPSCs से) हैं, तो अस्वीकृति न्यूनतम होती है लेकिन तकनीकी जटिलता अधिक होती है। एलोजेनिक कोशिकाएं (किसी अन्य दाता या स्टेम सेल लाइन से) उत्पादन करने में आसान होती हैं लेकिन मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा हमला किया जा सकता है। पशु अध्ययनों में, शोधकर्ता अक्सर ग्राफ्ट के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं का उपयोग करते हैं। उदाहरण के लिए, बिल्ली के ऑर्गेनोइड प्रत्यारोपण अध्ययन में, ग्राफ्ट के जीवित रहने और कनेक्शन बनाने के लिए प्रणालीगत इम्यूनोसप्रेसिव की आवश्यकता थी (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। इम्यूनोसप्रेसिव के बिना, ज़ेनोजेनिक कोशिकाएं तेजी से साफ हो जाती हैं। दिलचस्प बात यह है कि रेटिनल प्रत्यारोपण के अधिकांश प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में पूर्ण अस्वीकृति के बजाय केवल निम्न-श्रेणी की सूजन की रिपोर्ट दी गई है – जो आंख की बाधाओं का एक लाभ है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। हालांकि, दीर्घकालिक सफलता के लिए या तो क्षणिक इम्यूनोसप्रेसिव या उन्नत तकनीकों (जैसे प्रतिरक्षा-बचने वाले कोटिंग्स के साथ कोशिकाओं को “छिपाना”) की आवश्यकता होगी (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। किसी भी भविष्य के मानव परीक्षण को इसे संबोधित करने की आवश्यकता होगी ताकि दाता आरजीसी मेजबान टी-कोशिकाओं द्वारा मारे न जाएं।

एक संबंधित चिंता ट्यूमरजेनेसिटी है। यदि अविभेदित कोशिकाएं प्रत्यारोपित की जाती हैं तो प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं टेराटोमा बना सकती हैं। आरजीसी तैयारी में प्रदूषक PSCs की थोड़ी सी संख्या भी विनाशकारी हो सकती है। इस प्रकार, शोधकर्ता ग्राफ्टेड आबादी की उच्च शुद्धता पर जोर देते हैं। व्राथाशा एट अल. ने उल्लेख किया है कि “टेराटोमा गठन के जोखिम को कम करने के लिए दाता आरजीसी की शुद्धता निर्धारित करना महत्वपूर्ण है” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। इसके लिए गहन गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता है – उदाहरण के लिए, आरजीसी-विशिष्ट रिपोर्टर्स के माध्यम से कोशिकाओं को छांटना या फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना, और यह सुनिश्चित करने के लिए जीनोम मिथाइलेशन या जीन अभिव्यक्ति परख द्वारा परीक्षण करना कि कोई प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं शेष नहीं हैं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। अब तक, छोटे पशु आरजीसी प्रत्यारोपण प्रयोगों में कोई ट्यूमर रिपोर्ट नहीं किया गया है, लेकिन क्लिनिकल अनुवाद के लिए किसी भी स्टेम-सेल उत्पाद के लिए अत्यंत कठोर शुद्धिकरण और रिलीज परीक्षण अनिवार्य होगा।

दृष्टिकोण: ग्लूकोमा के लिए मानव परीक्षणों की ओर

उपरोक्त जबरदस्त चुनौतियों को देखते हुए, ग्लूकोमा रोगियों में आरजीसी प्रतिस्थापन के पहले नैदानिक ​​परीक्षण की उम्मीद कब की जा सकती है? दुर्भाग्य से, उत्तर शायद “जल्दी नहीं” है। यह क्षेत्र अभी भी प्रारंभिक प्रीक्लिनिकल चरणों में है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। आज तक, ग्लूकोमा में आरजीसी प्रत्यारोपण के लिए कोई भी मानव परीक्षण विशेष रूप से पंजीकृत नहीं है। मौजूदा “स्टेम सेल क्लीनिक” (उदाहरण के लिए, ऑटोलॉगस वसा या अस्थि मज्जा कोशिकाओं के भ्रामक परीक्षण) ने तदर्थ दृष्टिकोणों पर ध्यान केंद्रित किया है और, स्पष्ट रूप से, नुकसान पहुंचाया है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। मरीजों को अप्रमाणित उपचारों से सावधान रहना चाहिए जो एफडीए की निगरानी को दरकिनार करते हैं। वैध फर्स्ट-इन-ह्यूमन परीक्षणों के लिए जानवरों में प्रत्येक बाधा को संबोधित करने वाले अवधारणा का ठोस प्रमाण और मजबूत सुरक्षा डेटा की आवश्यकता होगी। इसमें कई साल लग सकते हैं।

एक व्यावहारिक दृष्टिकोण यह है कि यदि प्रगति जारी रहती है, तो छोटे सुरक्षा परीक्षण 2020 के दशक के अंत या 2030 के दशक में शुरू हो सकते हैं। उम्मीदवार संभवतः बहुत उन्नत बीमारी वाले रोगी (जहां रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका काफी हद तक डिस्कनेक्ट हो सकते), या इसके विपरीत मध्य-चरण की बीमारी वाले रोगी होंगे (किसी भी लाभ की संभावना को अधिकतम करने के लिए)। प्राथमिक अंतिम बिंदु शुरू में सुरक्षा होंगे: आंख में प्रतिकूल सूजन प्रतिक्रियाओं या ट्यूमर गठन की अनुपस्थिति। द्वितीयक अंतिम बिंदु ग्राफ्ट “टेक” के किसी भी शारीरिक या कार्यात्मक संकेतों का पता लगाने का लक्ष्य रखेंगे। उदाहरण के लिए, रेटिना की इमेजिंग (ऑप्टिकल कोहेरेंस टोमोग्राफी) रेटिनल तंत्रिका फाइबर परत या गैन्ग्लियन कोशिका परत में कोशिकाओं को इंजेक्शन दिए जाने वाले स्थान पर गाढ़ापन देख सकती है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परीक्षण, जैसे पैटर्न इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (पीईआरजी) या विज़ुअल इवोक्ड पोटेंशियल्स (वीईपी), ग्राफ्टेड कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाली विद्युत प्रतिक्रियाओं को प्रकट कर सकते हैं। अंततः, कार्यात्मक दृष्टि परीक्षण (जैसे दृश्य क्षेत्र या कंट्रास्ट संवेदनशीलता) महत्वपूर्ण होंगे, लेकिन दृष्टि के एक छोटे से चाप की बहाली का प्रदर्शन भी अभूतपूर्व होगा। सादृश्य से, वंशानुगत रेटिनल रोग के लिए हाल के जीन थेरेपी परीक्षण संरचनात्मक बनाम कार्यात्मक श्रेणियों में परिणामों को मापते हैं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov); समान श्रेणियां (OCT एनाटॉमी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, विज़ुअल फंक्शन, रोगी-रिपोर्टेड विजन) लागू होंगी।

संक्षेप में, जबकि सतर्क आशावाद है, कोई भी व्यावहारिक समय-सीमा लंबी है। ऊपर उल्लिखित प्रत्येक चरण को परिष्करण की आवश्यकता है। एक यथार्थवादी पहला परीक्षण 2030 के दशक के मध्य से अंत तक डिजाइन किया जा सकता है, जो एक्सॉन पुनर्जनन और सुरक्षा प्रोफाइल में सफलताओं पर निर्भर करेगा। उम्मीदवारों और अंतिम बिंदुओं को सावधानीपूर्वक चुना जाएगा: संभवतः पहले सुरक्षा-संबंधी अंतिम बिंदु, उसके बाद एकीकरण के सरोगेट (इमेजिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) होंगे, मापने योग्य दृष्टि लाभ की उम्मीद करने से पहले। दूसरे शब्दों में, इस क्षेत्र को आशा और यथार्थवाद के बीच संतुलन बनाना होगा – आरजीसी प्रतिस्थापन का पीछा एक त्वरित स्प्रिंट के बजाय अनुसंधान की एक मैराथन होगी।

निष्कर्ष

ग्लूकोमा में खोई हुई आरजीसी को लैब-में-विकसित समकक्षों से बदलना एक रोमांचक लेकिन प्रारंभिक विचार है। इन विट्रो में, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को आरजीसी-जैसी कोशिकाओं में बदला जा सकता है जो प्रमुख मार्करों और यहां तक कि कुछ उपप्रकार विशेषताओं को व्यक्त करती हैं (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। जानवरों में प्रत्यारोपण अध्ययनों से पता चला है कि इन कोशिकाओं का एक अंश महीनों तक जीवित रह सकता है, रेटिनल सर्किट्री में एकीकृत हो सकता है, और संभावित रूप से सिनैप्स बना सकता है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)। हालांकि, भारी बाधाएं बनी हुई हैं। लैमना क्रिब्रोसा से परे एक्सॉन का विकास खराब है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), केंद्रीय लक्ष्यों के लिए मार्गदर्शन अपर्याप्त रूप से नियंत्रित है, सिनैप्स कमजोर या अनुपस्थित हैं, और एक्सॉन में माइलिन की कमी है (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)। इसके अलावा, प्रतिरक्षा अस्वीकृति और ट्यूमर के जोखिमों को प्रबंधित किया जाना चाहिए। फिलहाल, शोधकर्ता बारी-बारी से प्रत्येक चुनौती से निपट रहे हैं। जब तक हम स्टेम-सेल आरजीसी को विश्वसनीय रूप से विकसित, वितरित और कनेक्ट नहीं कर सकते, तब तक दृष्टि-बहाल करने वाले प्रत्यारोपण लैब में ही रहेंगे। लेकिन स्थिर प्रगति आशा का एक माप देती है: निरंतर नवाचार और सावधानी के साथ, “पेट्री-डिश से ऑप्टिक ट्रैक्ट” आरजीसी प्रतिस्थापन का सपना एक दिन प्रयोग से इलाज में बदल सकता है।