Sissejuhatus

Glaukoom on maailmas peamine pöördumatu pimeduse põhjustaja, sest silma ajuga ühendavad võrkkesta ganglionirakud (RGC-d) surevad ega suuda taastuda (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ilma RGC-deta ei jõua visuaalsed signaalid võrkkestast ajukeskustesse (nagu lateraalne genikulaartuum ja ülemine künkakese), mistõttu nägemine kaob. Praegused glaukoomi ravimeetodid (nt silmasisese rõhu alandamine) võivad kaitsta ellujäänud RGC-sid, kuid ei suuda taastada juba kadunuid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tüvirakkude teraapia eesmärk on asendada kadunud RGC-d, diferentseerides inimese pluripotentsed tüvirakud (kas embrüonaalsed tüvirakud, ESC-d, või indutseeritud pluripotentsed tüvirakud, iPSC-d) RGC-deks ja siirdades need silma (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Põhimõtteliselt võiks see pakkuda piiramatut allikat võrkkesta neuronitele (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Selle visiooni elluviimine nõuab aga tohutute väljakutsete ületamist: uued RGC-d peavad ellu jääma, kasvatama aksonid läbi silma väljapääsu (lamina cribrosa) nägemisnärvi, navigeerima pikki vahemaid täpsete aju sihtmärkideni, moodustama funktsionaalseid sünapseid ja müeliniseeruma – seda kõike täiskasvanud kesknärvisüsteemi pärssivas keskkonnas.

Käesolev artikkel annab ülevaate inimese tüvirakkudest RGC-de saamise ja nende loomamudelitesse siirdamise hetkeseisust. Seejärel käsitleme kriitilisi eduteid takistavaid tegureid – aksonite laienemist läbi lamina cribrosa, suunamist talamuse ja künkakese sihtmärkidele, sünapside moodustumist ja müelinisatsiooni – samuti ohutusküsimusi (immuunne äratõukereaktsioon, kasvajate oht) ja manustamismeetodeid (intravitreaalne vs. subretinaalne süstimine). Lõpetuseks anname realistliku ülevaate sellest, millal võivad glaukoomi puhul olla teostatavad esimesed inimkatsetused ja milliseid tulemõõdikuid need nõuaksid. Kogu artikli vältel püüame olla selged: olulised terminid on paksus kirjas ja kõik tehnilised kontseptsioonid on selgitatud tavalugejale arusaadavaks.

RGC-de diferentseerimine inimese pluripotentsetest tüvirakkudest

Teadlased on välja töötanud palju protokolle, et muuta inimese ESC-d või iPSC-d RGC-laadseteks neuroniteks. Tavaliselt suunatakse tüvirakud esmalt võrkkesta eellasrakkude seisundisse, kasutades kasvufaktorite ja väikeste molekulide kombinatsioone, mis jäljendavad silma arengut (näiteks FGF, IGF, BMP, Wnt ja Notchi raja modulaatorid) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Õigetes tingimustes diferentseeruvad need rakud edasi RGC-deks, mida saab kinnitada RGC-markeritega. Peamised markerid hõlmavad transkriptsioonifaktoreid BRN3B (POU4F2) ja ISL1, RNA-d siduvat valku RBPMS, neuronaalset tsütoskeleti valku β-III tubuliin (TUJ1) ja süntsapin-γ (SNCG). Tõepoolest, üks uuring näitas, et PSC-st saadud kultuurid ekspresseerisid mitmeid RGC-markereid: „transkriptsioonifaktorid nagu BRN3, ISL1 ja SNCG“ ilmusid koos pikkade neuriitidega, kinnitades RGC identiteeti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Need tüvirakkudest pärinevad RGC-d sarnanevad oma looduslike vastetega geeniekspressiooni ja morfoloogia poolest, ulatudes pikkade protsessidega ja tekitades aktsioonipotentsiaale.

RGC-d ei ole ühtne rakutüüp. Eksisteerivad kümned RGC alltüübid (nt liikumistundlikud suunatundlikud rakud, on/off-keskuse rakud, sisemiselt valgustundlikud melanopsiinirakud, alfa-RGC-d jne), millest igaühel on omaette funktsioonid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Loomauuringud on katalooginud 30+ RGC alltüüpi anatoomia ja molekulaarsete markerite alusel (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ja tõendid viitavad, et inimestel on ligikaudu 20 või rohkem alltüüpi unikaalsete ühendustega (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teoreetiliselt saaks tüvirakkude protokolle kohandada konkreetsete alltüüpide tootmiseks, kohandades arengulisi märke. Praktikas püüdlevad enamik praeguseid meetodeid segatud RGC populatsiooni poole. Seejärel kontrollivad teadlased alltüüpide mitmekesisust markerite kombinatsioonide koorvärvimise teel: näiteks ühes inimese RGC diferentseerumisuuringus tuvastati nende BRN3+ rakkude hulgast kandidaat on–off suunatundlikud RGC-d (ekspresseerivad CART-i) ja alfa-RGC-d (ekspresseerivad SPP1/osteopontiini) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Alltüüpide spetsifikatsiooni optimeerimine on aktiivne uurimisvaldkond, kuna iga RGC alltüüp (oma eel- ja post-sünaptiliste partneritega) vajab sobivat integratsiooni in vivo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

RGC-de genereerimise efektiivsus ja kiirus on paranenud. Varasemad protokollid võtsid mitu nädalat või kuud, kuid uuemad meetodid kiirendavad protsessi. Näiteks Luo jt konstrueerisid transkriptsioonifaktori NGN2 üleekspressiooni ja neurotroopse söötme, et toota RGC-laadseid neuroneid vaid kahe nädalaga, võrreldes 1–2 kuuga varasemates 2D- või 3D-kultuurides (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Need rakud ekspresseerisid RGC-markereid ja siirdatuna täiskasvanud rottide silmadesse, „migreerusid edukalt ganglionrakukihti 1 nädala jooksul“ (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Samamoodi annavad 3D võrkkesta organoididena (mis rekapituleerivad silma arengut) kasvatatud pluripotentsed tüvirakud loomulikult RGC-sid koos teiste võrkkesta neuronitega. Organoididest pärinevatel RGC-del kipub olema loote RGC-dega sarnasem geeniekspressiooniprofiil kui 2D-kultuuridel, ja paljud uurimisrühmad koguvad nüüd siirdamiskatseteks organoididest RGC-rikastatud rakke (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Vaatamata sellele edule on saagikus endiselt tagasihoidlik ja kultuurid heterogeensed. Protokollid toodavad sageli segatud võrkkesta rakupopulatsiooni, milles on vähemus RGC-sid, ja ellujäämine kultuuris võib olla piiratud (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teadlased kasutavad tavaliselt rakkude sorteerimist (nt Thy1 või BRN3 reporterite abil), et puhastada RGC-sid enne siirdamist. Peamine eesmärk on saavutada väga kõrge puhtusaste, sest diferentseerumata või valesse sihtkohta sattunud rakud võivad põhjustada kasvajate teket. Hiljutine uuring hoiatas, et „tõlkeuuringute jaoks on ülioluline määrata doonor-RGC-de puhtus, et vähendada teratoomi moodustumise riski“ (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Siirdamine loomamudelites: ellujäämine ja integratsioon

Mitmed prekliinilised uuringud on nüüd loomamudelites testinud inimese tüvirakkudest saadud RGC-sid. Eesmärgid hõlmavad näitamist, et siirdatud RGC-d suudavad ellu jääda, integreeruda retsipiendi võrkkestasse, saata välja aksoneid ja (lõpuks) signaale edastada. Katseid on tehtud peamiselt närilistel (hiired, rotid), aga ka suurematel loomadel (kassid) ja inimahvidel.

Pärast RGC-de diferentseerimist või isoleerimist in vitro viivad uurijad need retsipiendi silma. Kaks peamist strateegiat on intravitreaalne süstimine (rakkude süstimine klaaskehasse, silma sisemisse õõnsusse) või subretinaalne manustamine (rakkude paigutamine võrkkesta alla). Tulemused varieeruvad:

- Intravitreaalne süstimine on tehniliselt lihtne RGC-de (mis asuvad võrkkesta sisepinnal) sihtimiseks. Mitmed rühmad on süstinud inimese RGC-de või võrkkesta organoididest saadud RGC-de suspensioone näriliste klaaskehasse. Näiteks süstisid Vrathasha jt umbes 50 000 inimese iPSC-RGC-d intravitreaalselt WS hiirtele ja leidsid, et siirdatud rakud lokaliseerusid ganglionrakukihis ja elasid ellu vähemalt viis kuud pärast siirdamist (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Need rakud arendasid välja normaalsed dendriitpuud ja tekitasid valguse poolt käivitatud aktsioonipotentsiaale, mis olid peaaegu identsed looduslike hiire RGC-dega (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), tõestades, et nad suudavad funktsionaalselt integreeruda vähemalt võrkkestas. Luo jt (2020) näitasid samamoodi, et hESC-st pärinevad RGC-laadsed rakud (NGN2 üleekspresseerivad) migreerusid täiskasvanud rottide ganglionikihti nädala jooksul (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Need tulemused on julgustavad, kuid rakkude arv, mis tegelikult integreeruvad, on üldiselt väike. Vrathasha teatas keskmiselt ~672 ellujäänud doonorrakust hiire võrkkesta kohta (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) – see on väike osa normaalsetest RGC-de arvudest –, rõhutades väljakutseid pakkuvat keskkonda.

Üks probleem lihtsate intravitreaalsete suspensioonidega on see, et rakud kipuvad sageli kokku kleepuma või ei kleepu. RGC-kahjustuse kassimudelis leidsid Becker jt, et intravitreaalne raku suspensiooni süstimine põhjustas rakkude agregatsiooni ja vähest tõelist integratsiooni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nad märkisid, et karkassi kasutamine võiks parandada ellujäämist ja võrkkesta migratsiooni. Tõepoolest, mõned uuringud manustavad nüüd RGC-sid biomateriaalsetele karkassidele või organoidkoesse, et neid toetada. Näiteks siirdati inimese võrkkesta organoidid (kogudes RGC-sid arengu 60–70 päeval) subretinaalselt kassi silmadesse. Süsteemse immunosupressiooniga elasid need organoidsiirikud ellu vähemalt 1 kuu ja näisid moodustavat sünaptilisi kontakte retsipiendi neuronitega (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Subretinaalne lähenemine tagas kindla kontakti doonorkoe ja võrkkesta vahel, samas kui intravitreaalsed rakususpensioonid kippusid hõljuma või kokku kleepuma. Teisest küljest on subretinaalne manustamine keerulisem operatsioon ja seda võib piirata olemasolev ruum (subretinaalne ruum on neljajalgsetel ja primaatidel õhuke).

Väikeste näriliste puhul jääb intravitreaalne manustamine kõige tavalisemaks lähenemiseks. Pärast süstimist on edukad doonorrakud identifitseeritud rändamas retsipiendi võrkkesta ganglionrakukihti ja ekspresseerimas RGC markereid (BRN3, RBPMS) nädalaid kuni kuid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Mõned uuringud teatavad doonorrakkude uute dendriitide ja isegi algsete aksoni võsude kasvamisest nägemisnärvi pea suunas. Näiteks siirdatud hiPSC-RGC-d hiirtel näitasid keerukaid dendriitpuid ja (valgusega stimuleerimisel) genereerisid postsünaptilisi potentsiaale, mis viitas, et nad olid moodustanud sünapseid bipolaarsete/amokriinsete interneuronitega (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Siiski on oluline olla ettevaatlik: kogemused fotoretseptorite siirdamisega näitavad, et siirdatud fluorestseeruvad markerid võivad mõnikord jätta mulje, et siirdatud rakud on integreerunud, kuigi tegelikult andsid nad värvi ainult retsipiendi rakkudele (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tõelise integratsiooni kinnitamiseks on vaja ranget märgistamist ja funktsionaalset testimist. Kõigil seni teadaolevatel juhtudel elab ja integreerub vaid osa süstitud RGC-dest. Näiteks süstisid Vrathasha jt 500 000 rakku, kuid hiljem loeti vaid ~0,13% (umbes 650 rakku) ellujäänuks 5 kuu möödudes (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ilmselgelt avaldab retsipiendi võrkkesta keskkond tugevat selektiivset survet ja ellujäämine jääb piiravaks teguriks.

Manustamisteed: intravitreaalne versus subretinaalne

Valikul, kuidas RGC-sid silma toimetada, on praktilised ja bioloogilised tagajärjed. Intravitreaalsed süstimised asetavad rakud silma geeli (klaaskehale) võrkkesta kõrvale. See tee peseb otse sisemist võrkkesta, kuid võib samuti allutada rakke difusiooniprobleemidele (nad peavad integratsiooniks võrkkesta pinnale kleepuma). Nagu eespool märgitud, võivad ilma toeta rakususpensioonid kokku kleepuda; ellujäämine võib olla kehv, kui rakud ei migreeru kiiresti retsipiendi koesse. Mitmed uuringud on leidnud, et karkassil põhinevad või organoidipõhised siirikud (üksikrakkude suspensioonide asemel) parandavad tulemusi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Intravitreaalse manustamise eeliseks on suhteliselt lihtne tehnika (seda kasutatakse juba ravimite süstimiseks ja geeniteraapia vektorite jaoks) ning RGC-de otsene sihtimine.

Seevastu subretinaalset manustamist (rakkude paigutamine võrkkesta ja võrkkesta pigmentepiteeli vahele) kasutatakse traditsiooniliselt fotoretseptorite või RPE siirdamiseks. RGC siirdamisel on see vähem intuitiivne, kuid võib pakkuda soodsat kontakti. Singhi jt kassi uuringus implanteeriti inimese võrkkesta organoidid subretinaalselt tihedalt retsipiendi võrkkestale. Vaatamata immunosupressiooni vajadusele elasid need siirikud nädalaid ja näitasid sünapsi moodustumise märke võrkkesta ganglionirakkudega (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kitsas subretinaalne ruum hoidis doonorrakke paigal. Kuid kassidel ja primaatidel on see ruum äärmiselt õhuke, mis muudab sihtimise keeruliseks. Subretinaalne operatsioon kaasneb ka suurema riskiga retsipiendi võrkkestale. Seega jääb intravitreaalne süstimine näriliste puhul standardlähenemiseks, samas kui suuremates silmades võidakse uurida subretinaalseid või epiretinaalseid (võrkkesta pinnale) strateegiaid.

Kokkuvõttes on intravitreaalne süstimine kõige lihtsam, kuid nõuab sageli karkasse või suurt rakkude arvu ellujäämiseks (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Subretinaalsed siirikud/kogumikud võivad saavutada kindla kontakti (nagu Singhi kassi uuringus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)), kuid esitavad kirurgilisi väljakutseid. Mõlemaid teid uuritakse ja on võimalik, et tulevased protokollid ühendavad rakkude manustamise biokompatiilsetesse karkassidesse või geelidesse, et maksimeerida doonor-retsipiendi liidestumist.

Aksonite regeneratsiooni ja ühenduvuse takistused

Isegi kui siirdatud RGC-d jäävad ellu ja paigutuvad silma, takistavad suured takistused nende võimet edastada nägemist ajju. Normaalses (täiskasvanud) kesknärvisüsteemis ei kasva kahjustatud nägemisnärvi kiud hästi tagasi. Siirdatud RGC-d seisavad silmitsi sama vaenuliku keskkonnaga. Peamised takistused hõlmavad järgmist:

Aksonite kasv läbi lamina cribrosa

Lamina cribrosa on nägemisnärvi peas asuv sõelataoline struktuur, kus RGC aksonid silmast väljuvad. See on taaskasvu peamine pudelikael. Loomkatsetes leiavad teadlased, et vähesed siirdatud RGC aksonid ületavad seda barjääri. Üks hoolikas uuring teatas, et „kui RGC-d süstiti klaaskehasse, integreerusid vähesed neist võrkkestasse. Nendest RGC-dest, mis edukalt GCL-i integreerusid, kasvasid paljudel välja aksonid, mis suundusid nägemisnärvi pea poole, kuid vähesed kasvasid lamina cribrosast mööda (~10%)“ (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teisisõnu, 90% uutest aksonitest peatus lamina juures. Lamina sisaldab tihedat gliaal- ja ekstratsellulaarset maatriksit, mis tõenäoliselt toodab inhibeerivaid signaale ja füüsilisi barjääre. Selle takistuse ületamine võib nõuda kas doonori aksonite insenerimist (näiteks kasvuvõimeid soodustavate radade nagu mTOR või Wnt ülesreguleerimise teel) või lamina keskkonna modifitseerimist (näiteks ensüümide kasutamine või inhibeerivate molekulide neutraliseerimine). See probleem on analoogne mis tahes seljaaju vigastusega: KNS-i aksoni regeneratsiooni ebaõnnestumise omadus. See viitab, et isegi kui paigutame RGC-d silma, nõuab nende aksonite nägemisnärvi viimine väga tugevaid pro-regeneratiivseid stiimuleid.

Suunamine aju sihtmärkidesse

Eeldades, et RGC aksonid suudavad silmast väljuda, on järgmiseks väljakutseks aksonite suunamine pikkade vahemaade taha õigetesse sihtmärkidesse (peamiselt talamuse lateraalne genikulaartuum (LGN) ja keskaju ülemine künkakese). Arengu käigus juhitakse RGC aksoneid molekulaarsete gradientide (nt efrin-A/EphA valgud) ja spontaanse võrkkesta aktiivsuse abil. Täiskasvanud ajul puuduvad need juhised üldjuhul. Mõned näriliste uuringud on näidanud, et on võimalik suunata regenereeruvaid RGC aksoneid uuesti ühenduma ülemise künkakesega: näiteks üks nägemisnärvi trakti kahjustuse mudel suurendas kasvuvõimeid soodustavate geenide (mTOR, JAK/STAT) ekspressiooni ja täheldas künkakeses uusi sünapseid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Need regenereerunud aksonid aga ei taastanud nägemist, kui neid ei toetatud kunstlikult (vt müelinisatsiooni allpool). Lühidalt öeldes on õigete juhtsignaalide leidmine (või nende pakkumine) avatud uurimisküsimus. Siirdatud RGC aksonid peaksid ideaalis kordama embrüonaalseid juhtsignaale, et moodustada ajus õige retinotopiline kaart, kuid jääb ebaselgeks, kuidas seda täiskasvanutel saavutada.

Sünapside moodustamine

Uued aksonid peavad lõpuks moodustama sünapseid õigete sihtneuronidega. Julgustav on, et tõendid viitavad sellele, et siirdatud RGC-d suudavad moodustada sünaptilisi ühendusi vähemalt võrkkestas. Johnsoni jt uuringus arendasid hiPSC-st pärinevad RGC-d, mis migreerusid retsipiendi GCL-i, normaalsed dendriitpuud. Sünaptiliste markerite värvimist ja valguse stimuleerimist kasutades demonstreerisid autorid „uute ja funktsionaalsete sünapside moodustumist doonor-RGC-de ja retsipiendi võrkkesta vahel“ (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teisisõnu, siirdatud RGC-d suutsid ühenduda bipolaarsete/amokriinsete interneuronitega ja edastada signaale allavoolu retsipiendi rakkudele, kuigi reaktsioonid olid mõnevõrra nõrgemad kui looduslikel rakkudel. See leid näitab, et vähemalt sisemise võrkkesta tasandil võib toimuda sobiv ühendus.

Sünapside moodustamine ajus on veelgi raskem saavutada ja mõõta. Mõned regeneratsiooniuuringud (mitte siirdamisuuringud iseenesest) on indutseerinud RGC aksoneid kasvama tagasi künkakese suunas ja moodustama sünapseid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eespool mainitud nägemisnärvi trakti kahjustuse mudelis moodustasid suprachiasmaatilises/künkakese piirkonnas uued aksonid sünapseid, kuid hiirtel puudus endiselt mõõdetav visuaalne käitumine. Seda omistati hiljem müeliini puudumisele (vt järgmist jaotist), mitte vigastele sünapsidele (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kokkuvõttes: Sünaptogenees on põhimõtteliselt võimalik, kuid nägemise taastavate tugevate, täpselt sihistatud sünapside tagamine on suur takistus. See nõuab tõenäoliselt „arengulaadseid“ signaale, nagu mustriline valgusstimulatsioon (võrkkesta lained) või toetavate gliiarakkude koos-siirdamine, et suunata ja tugevdada uusi ühendusi.

Regenereerunud aksonite müelinisatsioon

Lõpuks, RGC aksonid müeliseeruvad tavaliselt alles pärast lamina cribrosa läbimist – silma huvitav disainifunktsioon. Oligodendrotsüüdid (KNS-i müelinisatsiooni rakud) hoitakse lamina poolt võrkkestast eemal (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Kui siirdatud RGC akson väljub silmast, siseneb see KNS-i, kus on müelinisatsiooniga glia. Kuid paljudes eksperimentaalsetes juhtudel jäävad uued aksonid müelinisatsioonita. See on oluline, sest müelinisatsioonita pikad KNS-i aksonid juhivad impulsse väga halvasti. Eespool kirjeldatud nägemisnärvi trakti regeneratsiooni uuringus leidsid autorid, et äsja moodustunud aksonid olid müelinisatsioonita ja hiirtel ei ilmnenud nägemise paranemist, välja arvatud juhul, kui neile anti 4-aminopüridiini (4-AP) – ravimit, mis blokeerib kaaliumikanaleid ja suurendab juhtivust demüeliniseeritud kiududes (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tegelikult taastas 4-AP osaliselt nägemise, kompenseerides müeliini puudujääki. See tulemus rõhutab punkti: isegi kui RGC akson jõuab oma sihtmärgini, siis ilma müeliinita ei juhi see signaale nägemiseks piisavalt kiiresti. Õige müelinisatsiooni tagamine – ehk oligodendrotsüütide eellasrakkude koos-siirdamise või retsipiendi glia stimuleerimise teel – on otsustava tähtsusega.

Kokkuvõttes seisavad siirdatud RGC-d silmitsi katsumusega: vaid vähesed kasvavad lamina cribrosast mööda (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), nad peavad leidma õige koridori aju sihtmärkidesse, moodustama sobivad sünapsid ja seejärel müeliini sisse pakkima. Iga samm on loomamudelites seni saavutanud vaid osalist edu. Nende takistuste ületamine on neuroregeneratsiooni aktiivne uurimisvaldkond.

Immuunsüsteemi ja ohutuse väljakutsed

Silm on suhteliselt immuunprivilegeeritud, kuid rakkude siirdamine kätkeb endas endiselt immuunrünnaku ohtu. Kui doonorrakud on autoloogsed (patsiendi enda iPSC-dest), on äratõukereaktsioon minimaalne, kuid tehniline keerukus kõrge. Allogeensed rakud (teiselt doonorilt või tüvirakuliinilt) on lihtsamini toodetavad, kuid retsipiendi immuunsüsteem võib neid rünnata. Loomauuringutes kasutavad teadlased sageli immunosupressiivseid ravimeid siiriku ellujäämise soodustamiseks. Näiteks kassi organoidi siirdamise uuringus oli siiriku ellujäämiseks ja ühenduste moodustamiseks vajalik süsteemne immunosupressioon (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ilma immunosupressioonita eemaldatakse ksenogeensed rakud kiiresti. Huvitaval kombel teatavad enamik võrkkesta siirdamise prekliinilisi uuringuid ainult madala astme põletikust, mitte täielikust äratõukereaktsioonist – silma barjääride eelisest (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pikaajaline edu nõuab siiski tõenäoliselt kas mööduvat immunosupressiooni või arenenud tehnikaid (nagu rakkude „varjamine“ immuunsüsteemi vältivate katetega) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kõik tulevased inimkatsetused peaksid seda käsitlema, et retsipiendi T-rakud ei hävitaks doonor-RGC-sid.

Seotud murekoht on tumorigeensus. Pluripotentsed tüvirakud võivad moodustada teratoome, kui siirdatakse diferentseerumata rakke. Isegi väike kogus saastunud PSC-sid RGC preparaadil võib olla katastroofiline. Seega rõhutavad teadlased siirdatud populatsiooni kõrget puhtust. Vrathasha jt märgivad, et on „ülioluline määrata doonor-RGC-de puhtus, et vähendada teratoomi moodustumise riski“ (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). See nõuab põhjalikku kvaliteedikontrolli – näiteks rakkude sorteerimine RGC-spetsiifiliste reporterite abil või voolutsütomeetria kasutamine ning testimine genoomi metülatsiooni või geeniekspressiooni analüüside abil, et tagada pluripotentsete rakkude puudumine (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Seni ei ole väikeloomade RGC siirdamiskatsetes kasvajaid teatatud, kuid kliiniline rakendamine nõuab iga tüvirakutoote äärmiselt ranget puhastamist ja vabastamistestimist.

Väljavaated: glaukoomi inimkatsetuste poole

Arvestades ülaltoodud tohutuid väljakutseid, millal võiks realistlikult oodata esimest kliinilist uuringut RGC asendamise kohta glaukoomihaigetel? Kahjuks on vastus tõenäoliselt „mitte niipea“. Valdkond on veel varases prekliinilises staadiumis (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Siiani ei ole registreeritud ühtegi inimkatset, mis oleks spetsiaalselt mõeldud RGC siirdamiseks glaukoomi puhul. Olemasolevad „tüvirakkude kliinikud“ (näiteks eksitavad uuringud autoloogsete rasva- või luuüdirakkudega) on keskendunud ad hoc lähenemistele ja, mis on märkimisväärne, põhjustanud kahju (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Patsiendid peaksid olema ettevaatlikud tõestamata ravimeetodite suhtes, mis kõrvalehoiduvad FDA järelevalvest. Seaduslikud esimesed inimkatsetused nõuaksid loomadele kõigi takistuste lahendamisel kindlat kontseptsiooni tõestamist ja usaldusväärseid ohutusandmeid. See võib võtta aastaid.

Pragmaatiline seisukoht on, et väikesed ohutusuuringud võivad alata 2020. aastate lõpus või 2030. aastatel, kui progress jätkub. Kandidaatideks oleksid tõenäoliselt väga kaugelearenenud haigusega patsiendid (kus võrkkest ja nägemisnärv võivad olla suures osas lahti ühendatud) või vastupidi, keskmises staadiumis haigusega patsiendid (maksimeerimaks igasuguse kasu võimalust). Peamised tulemused oleksid esialgu ohutus: kahjulike põletikuliste reaktsioonide või kasvaja tekkimise puudumine silmas. Teisesed tulemused püüaksid tuvastada siiriku „vastuvõtmise“ anatoomilisi või funktsionaalseid märke. Näiteks võrkkesta kuvamine (optiline koherentstomograafia) võiks otsida võrkkesta närvikiu kihi või ganglionrakukihi paksenemist süstitud rakkude kohal. Elektrofülosoloogilised testid, nagu mustriga elektroretinogramm (PERG) või visuaalselt esilekutsutud potentsiaalid (VEP), võivad paljastada siirdatud rakkudest pärinevaid elektrilisi vastuseid. Lõppkokkuvõttes oleksid olulised funktsionaalsed nägemistestid (nagu nägemisväljad või kontrasti tundlikkus), kuid isegi väikese nägemiskaare taastamise demonstreerimine oleks murranguline. Analoogselt mõõdavad pärilike võrkkestahaiguste geeniteraapia hiljutised uuringud tulemusi struktuurilistes vs. funktsionaalsetes kategooriates (pmc.ncbi.nlm.nih.gov); rakendatavad oleksid sarnased kategooriad (OCT anatoomia, elektrofüloloogia, visuaalne funktsioon, patsiendi poolt teatatud nägemine).

Kokkuvõttes, kuigi on olemas ettevaatlik optimism, on igasugune praktiline ajakava pikk. Kõik ülaltoodud sammud vajavad täpsustamist. Realistlik esimene uuring võidakse kavandada 2030. aastate keskel või lõpus, sõltuvalt edusammudest aksonite regeneratsioonis ja ohutusprofiilides. Kandidaadid ja tulemusnäitajad valitaks hoolikalt: tõenäoliselt esmalt ohutusel põhinevad tulemusnäitajad, millele järgnevad integratsiooni surogateedid (kuvamine, elektrofüloloogia), enne kui oodata mõõdetavaid nägemise paranemisi. Teisisõnu, valdkond peab tasakaalustama lootust realismiga – RGC asendamise poole püüdlemine on pigem uurimismaraton kui kiire sprint.

Kokkuvõte

Kaotatud RGC-de asendamine glaukoomi puhul laboratooriumis kasvatatud vastetega on põnev, kuid alles tekkiv idee. In vitro saab inimese pluripotentsetest tüvirakkudest indutseerida RGC-laadseid rakke, mis ekspresseerivad võtmemarkereid ja isegi mõningaid alltüübi tunnuseid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Loomadel tehtud siirdamisuuringud on näidanud, et osa neist rakkudest suudab ellu jääda kuid, integreeruda võrkkesta närvivõrgustikku ja potentsiaalselt moodustada sünapseid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kuid tohutud takistused jäävad. Aksonite kasv üle lamina cribrosa on kehv (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), suunamine keskmistesse sihtmärkidesse on ebapiisavalt kontrollitud, sünapsid on nõrgad või puuduvad ja aksonitel puudub müeliin (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Lisaks tuleb hallata immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni ja kasvajariske. Praegu jätkavad teadlased iga väljakutsega tegelemist. Kuni me ei suuda usaldusväärselt kasvatada, manustada ja ühendada tüvirakkudest RGC-sid, jäävad nägemist taastavad siirdamised laborisse. Kuid pidev edasiminek annab lootust: jätkuva innovatsiooni ja ettevaatlikkusega võib unistus „petri tassist nägemisnärvi trakti“ RGC asendamisest ühel päeval muutuda eksperimendist raviks.