Sissejuhatus

Nägemiskaotus nägemisnärvi kahjustuse või glaukoomi tõttu tekib seetõttu, et võrkkesta ganglionirakud (RGC-d) ei suuda oma aksoneid taastada. Täiskasvanud imetajatel on RGC-de sisemine kasvuprogramm tavaliselt välja lülitatud, mistõttu kahjustatud närvid iseenesest ei parane (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hiljutised hiirteuuringud näitavad, et geeniteraapia võib neid kasvuteid uuesti aktiveerida. Näiteks PTEN geeni (rakukasvu pidur) deletsioon täiskasvanud RGC-des lülitab sisse mTOR kasvutee ja viib tugevale aksonite taaskasvule (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Käesolevas artiklis vaatleme, kuidas PTEN/mTOR, KLF-perekonna geenide ja Sox11 manipuleerimine võib stimuleerida RGC aksonite regenereerimist, mida see on hiirtel saavutanud, ohutusküsimusi (nagu vähirisk), geenide edastamise viise (AAV viirusvektorid, intravitreaalne või suprachoroidaalne süst) ja milliseid samme on vaja, et liikuda ägedate kahjustusmudelite juurest kroonilise glaukoomi ravile.

RGC-de sisemised kasvuteed

PTEN/mTOR rada

Normaaltingimustes hoiavad täiskasvanud RGC-d mTOR-i teekonna suures osas välja lülitatuna, mis piirab nende võimet uusi aksoneid kasvatada (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN on geen, mis inhibeerib mTOR-i. Teadlased leidsid, et PTEN-i eemaldamine täiskasvanud hiire RGC-des vabastab mTOR-i signaalimise ja võimaldab aksonite taaskasvu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ühes märkimisväärses uuringus viis PTEN-i tingimuslik väljalülitamine täiskasvanud hiirtel tugeva nägemisnärvi regenereerimiseni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Umbes 8–10% ellujäänud RGC-dest kasvatas aksoneid üle 0,5 mm kaugusele kahjustusest, kusjuures mõned aksonid kasvasid üle 3 mm ja jõudsid isegi nägemisnärvide ristumiskohani 4 nädalat pärast kahjustust (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teise mTOR-i piduri, TSC1 geeni väljalülitamine indutseeris samuti aksonite taaskasvu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

PTEN-i deletsioon mitte ainult ei stimuleerinud taaskasvu, vaid parandas ka RGC ellujäämist (umbes 45% ellujäämist võrreldes ~20%-ga kontrollrühmades) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Siiski on olemas ohutusprobleem: PTEN on kasvaja supressor. Pikaajaline PTEN-i kadu võib soodustada kontrollimatut rakkude kasvu. Tõepoolest, üks oluline regenereerimisuuring märkis, et PTEN-i püsiv deletsioon oleks vähiriski tõttu kliiniliselt vastuvõetamatu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Selle lahendamiseks pakuvad teadlased välja kontrollitava geeniteraapia kasutamise (näiteks AAV-ga edastatav shRNA lülitatava promootori all), nii et PTEN-i aktiivsust saaks taaskasvu ajal välja lülitada ja seejärel uuesti sisse lülitada (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lühidalt öeldes on PTEN/mTOR võimas sisemine kasvulüliti, kuid seda tuleb hoolikalt kontrollida.

KLF-perekond ja Sox11

Teadlased on sihtinud ka transkriptsioonifaktoreid, mis kontrollivad aksonite kasvu. Krüppeli-laadsed faktorid (KLF-id) on selliste geenide perekond. Peamine leid on, et KLF4 toimib aksonite kasvu pidurina: KLF4-d mittesisaldavad RGC-d kasvavad paremini kui normaalsed (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hiirtel, kelle RGC-del puudub KLF4, kasvatasid need neuronid kultuuris palju pikemaid neuriteid ja pärast nägemisnärvi muljumist kasvas välja palju rohkem aksoneid. Näiteks kaks nädalat pärast kahjustust oli KLF4-knockout hiirtel oluliselt rohkem regenereeruvaid kiude üle 1 mm muljumiskohast kui metsikut tüüpi hiirtel (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teistel KLF-idel on erinevad rollid: mõned (nagu KLF6 ja KLF7) soodustavad kasvu, samas kui teised (nagu KLF9) pärsivad seda (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Seega võib KLF-i ekspressiooni tasakaalustamine eemaldada mõned arengulised „pidurid“ RGC kasvult (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Teine transkriptsioonifaktor on Sox11, mis on oluline arengus. Sox11 üleekspressioon täiskasvanud RGC-des (kasutades AAV geeniedastust) suurendas samuti regenereerimist. Ühes uuringus näitasid lisandunud Sox11-ga RGC-d märkimisväärset aksonite taaskasvu suurenemist pärast kahjustust (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sox11-l on aga vastandlikud mõjud: see soodustab taaskasvu teatud RGC tüüpides, kuid võib teisi tappa. Märkimisväärselt tappis Sox11 üleekspressioon peaaegu kõik nn. „alfa“ RGC-d (RGC alamtüüp), mis tavaliselt reageerivad hästi PTEN-põhistele ravimeetoditele (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teisisõnu, Sox11 programmeerib mõned RGC-d ümber kasvuvõimeliseks olekuks, kuid kahjustab ka teisi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teadlased järeldavad, et erinevad RGC alamtüübid vajavad erinevaid taaskasvustrateegiaid.

Peamised nägemisnärvi muljumise uuringud hiirtel

Nägemisnärvi kahjustuse hiiremudelid (nägemisnärvi muljumine) on näidanud, kuidas need geenimanipulatsioonid praktikas toimivad. Klassikaline lähenemine kombineeris teekondi maksimaalse efekti saavutamiseks. Ühes PNAS-i uuringus rakendasid teadlased kolm ravi: PTEN-i deletsioon, põletiku esilekutsumine silmas (sümosan) ja cAMP taseme tõstmine. See kolmikravi pani RGC-d aksoneid taastama kogu nägemisnärvi ulatuses ja aju nägemiskeskustesse (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ravitud hiirte ajude uurimisel jõudsid paljud regenereeruvad kiud lateraalsesse põlvekehasse, ülemisse künkasse ja teistesse nägemispiirkondadesse (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Oluliselt viis see taaskasv nägemisega seotud käitumise osalise taastumiseni. Ravitud hiired taastasid mõningase võime sooritada lihtsaid nägemisülesandeid: nad suutsid jälgida liikuvaid mustreid (optomotoorne refleks) ja hinnata sügavust paremini kui kahjustatud kontrollhiired (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Nad näitasid isegi paremaid ööpäevaseid valgusreaktsioone [20†L33-L38], kuigi neid üksikasju võib olla raske mõõta.) See töö näitas, et täiskasvanud hiirte pikaajaline aksonite regenereerimine suudab funktsionaalselt ühendada nägemissüsteemi osi.

Teised uuringud keskendusid üksikutele teguritele. Intravitreaalselt konstitutiivselt aktiivset TrkB-d (ajust pärinev neurotroopse faktori retseptor) kandva AAV manustamine põhjustas veelgi pikema kasvu. Näiteks Nishijima jt kasutasid AAV-ga edastatud konstrueeritud TrkB-d (nimetusega F-iTrkB) ja nägid aksonite taaskasvu üle 4,5 mm, kusjuures mõned jõudsid nägemisnärvide ristumiskohani (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Samamoodi andis kasvufaktorit soodustava geeni, nagu aktiivse K-Ras (tuntud onkogeen), sisestamine RGC-desse umbes 3 mm regenereerimist (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Huvitaval kombel ei leitud neis ravitud silmades kasvajaid, kuid autorid soovitavad siiski ohutuse tagamiseks kasutada indutseeritavaid sisse/välja geenilüliteid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Need ja teised uuringud kinnitavad, et sisemiste kasvugeenide sisselülitamine võib tõepoolest esile kutsuda regenereerimist hiirte nägemisnärvi kahjustuse mudelites.

Osaline nägemise taastumine

Hiirte eksperimendid jälgisid sageli mitte ainult anatoomiat, vaid ka funktsiooni. Optomotoorne refleks (hiired, kes jälgivad liikuvaid triipe) ja sügavustaju testid on lihtsad viisid nägemise paranemise jälgimiseks. Kolmikraviuuringus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) näitasid hiired nende reflekside osalist taastumist. Nad suutsid taas reageerida liikuvatele visuaalidele ja hinnata sügavust, samas kui ravita kahjustatud hiired seda ei suutnud (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). See on julgustav: see tähendab, et taaskasvanud aksonid lõid kasulikke ühendusi. Taastumine oli aga vaid osaline. Paljud nägemisteed (eriti peen pildivormiv nägemine) jäävad lahti ühendatuks. Siiani on regenereerimine taastanud põhilised visuaalsed reaktsioonid, kuid mitte täieliku nägemise. Siiski kinnitab igasuguse funktsionaalse paranemise nägemine nende strateegiate potentsiaali.

Ohutuskaalutlused

Kuigi geeniteraapia regenereerimiseks on paljutõotav, on ohutus kriitilise tähtsusega. Samad kasvuteed, mis aitavad aksoneid, võivad kontrollimatult jätta ka probleeme tekitada. Nagu märgitud, on PTEN-i püsiv deletsioon vähirisk (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Samamoodi võib mTOR-i krooniline aktiveerimine viia kasvaja tekkimiseni (näiteks TSC1/2 patsientidel tekivad kasvajad). Kasvufaktoreid (nagu konstrueeritud RAS või muud onkogeenid) esile kutsuvaid geeniteraapiaid tuleb hoolikalt kontrollida. Märkimisväärselt, eksperimentaalses AAV-RAS teraapias ei täheldatud hiirte silmades kasvajaid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), kuid autorid rõhutavad reguleeritud (indutseeritavate) süsteemide kasutamist juhuks, kui onkogeenset aktiivsust on vaja välja lülitada (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Muud ohutusprobleemid hõlmavad rakusurma ja immuunreaktsioone. Mõned sekkumised kahjustavad teatud rakke: näiteks tappis Sox11 üleekspressioon paljud alfa-tüüpi RGC-d (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Igasugune RGC-sid tapav teraapia tühistab selle kasu. On ka süstimisest või põletikust tuleneva kahjustuse oht. Põletiku esilekutsumine (sümosan) aitas hiirtel regenereerimisele kaasa, kuid inimestel oleks see ohtlik. AAV insertide pikaajalised mõjud (nagu insertiivne mutagenees) on madalad, kuid iga silma geeniteraapia vajab hoolikat hindamist. Lühidalt, iga kasvu soodustav geen tuleb tasakaalustada potentsiaalse kahjuga: ideaalis manustatakse seda ajutiselt või range kontrolli all.

Geenide edastamise strateegiad

Geenide õigetesse rakkudesse viimine on peamine väljakutse. RGC-de jaoks on adeno-seotud viirused (AAV-d) peamised vektorid. AAV-d on ohutud, mittepaljunevad viirused, mis suudavad kanda terapeutilisi geene võrkkesta rakkudesse. Tavaline meetod on intravitreaalne süst: AAV süstimine otse silma klaaskehageeli. AAV2 on klassikaline serotüüp võrkkesta transduktsiooniks; see jõuab tõhusalt RGC-desse, kui seda süstitakse intravitreaalselt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tegelikult leiti ühes uuringus, et intravitreaalne AAV2 transduktsioon tabas üle 90% RGC-dest (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kasutada saab ka teisi kapsiide. Näiteks intravitreaalselt manustatud AAV6 näitab väga kõrget tropismi sisemise võrkkesta ja RGC kihi suhtes (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teadlased konstrueerivad ka AAV2 variante (nagu mutatsioonid või kimeerid), et ületada võrkkesta barjääre veelgi paremini, kuid need üksikasjad arenevad.

Teine viis on suprachoroidaalne süst, kus nõel või mikrokannüül toimetab AAV sklera ja koroioidi (veresooneline kiht) vahele. See lähenemine levitab vektorit laialdaselt võrkkesta all. Ahvidel suprachoroidaalne AAV8 põhjustas laialdase geeniekspressiooni (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Seda saab teha spetsiaalselt disainitud mikronõeltega. Suprachoroidaalne manustamine väldib suurt operatsiooni, kuid on siiski invasiivne ja võib põhjustada lokaalset põletikku. Tegelikult põhjustas suprachoroidaalne AAV8 kerget korioretiniiti (koroioidi põletik), mis vajas steroide, kuigi see taandus nädalatega (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Oluline on, et suprachoroidaalne manustamine käivitas nõrgemaid süsteemseid antikehareaktsioone AAV kapsiidile kui intravitreaalne manustamine (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). See on tõenäoliselt tingitud sellest, et osa viirusest väljub silmast erinevalt. Üldiselt on suprachoroidaalne süst paljulubav geeniteraapia jaoks silma tagumisse ossa, kuid selle immuunefekte tuleb hallata.

Immunogeensus

Kuigi silm on teatud määral „immuunsüsteemi poolt privilegeeritud“, võib AAV geeniedastus siiski esile kutsuda immuunreaktsioone. Intravitreaalne AAV lekib sageli silmast välja drenaažikanalite kaudu. Üks uuring primaatidel leidis, et intravitreaalne AAV viis verevoolu umbes 400–500 korda rohkem viirust võrreldes subretinaalse süstiga (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). See põhjustas väga tugeva antikehareaktsiooni AAV kapsiidi vastu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Seevastu subretinaalne AAV (süstitud võrkkesta alla) on silmas isoleeritud ja tavaliselt esile kutsub peaaegu mitte mingeid anti-kapsiidi antikehi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprachoroidaalne AAV jääb vahepeale: osa viirusest jääb silma, samas kui osa jõuab lähedalasuvatesse kudedesse. Uuringud näitavad, et suprachoroidaalne AAV põhjustab leebemat anti-kapsiidi antikehade tootmist kui intravitreaalne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), kuid see võib stimuleerida immuunrakke geenitoote vastu (nagu näha GFP puhul), sest see transduktsioonib rakke väljaspool vere-võrkkesta barjääri (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Lisaks antikehadele võivad T-rakulised vastused rünnata transduktsioonitud rakke. Kui sisestatud geen toodab valku, mida organism peab võõraks (nagu GFP eksperimentides), võivad immuunrakud need rakud eemaldada. Isegi tõelised inimgeenid võivad mõnikord esile kutsuda madala taseme põletikku. Kliinilistes võrkkesta geeniteraapia uuringutes (nt RPE65 puhul) antakse sageli steroide selle reaktsiooni summutamiseks. Võrkkesta sisemuses püsivad manustamisviisid (subretinaalne, suprachoroidaalne) kipuvad üldiselt olema vähem immunogeensed kui klaaskehasüstid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tulevased teraapiad peavad tasakaalustama tõhusa manustamise minimaalse immuunaktiveerimisega, kasutades võimalik, et uuemaid AAV tüüpe või immuunsupressiivseid raviskeeme.

Glaukoomi ravi

Glaukoom esitab teistsuguse väljakutse kui äge närvi muljumine. Glaukoomi korral surevad RGC-d aeglaselt selliste tegurite tõttu nagu kõrge silmarõhk, vähenenud verevool ja stress. Glaukoomi raviks peab geeniteraapia toimima kroonilise kahjustuse tingimustes. See tähendab, et ajastus on oluline: teraapiaid võib olla vaja anda varakult RGC-de kaitsmiseks või perioodiliselt kasvufaktorite ümberhäälestamiseks. Õnneks on hakatud seda lünka ületama. Hiljutises uuringus kasutasid teadlased AAV-d, et manustada alati aktiivset TrkB retseptorit (F-iTrkB) glaukoomimudeli hiirte silmadesse. Need hiired näitasid nii RGC-de kaitset kui ka märkimisväärset aksonite regenereerimist (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). See viitab, et isegi glaukoomitingimustes aitab kasvuteede aktiveerimine.

Siiski nõuab muljumismudelitest inimeste glaukoomile üleminek rohkem samme. Peame neid geeniteraapiaid testima loommudelites glaukoomi korral (nagu esilekutsutud silmasisene hüpertensioon või geneetilised mudelid), mitte ainult muljumismudelites. Peame arvestama ka vananemise ja haigusega kahjustatud keskkonnaga: vanemad neuronid, armkude ja kõikuva silmarõhuga. Tõenäoliselt on vaja kombineerida geeniteraapiat standardse glaukoomiraviga (rõhu langetamine, neurotroopsete faktorite kasutamine) ja kasutada kontrollitud geenisüsteeme. Näiteks, nagu märgitud, võiksid AAV konstruktid kasutada indutseeritavaid promootoreid, et kasvufaktori geen saaks pärast aksonite taaskasvu välja lülitada (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kuna inimeste glaukoom progresseerub aeglaselt, ei pruugi ühekordne geenisüst olla piisav; võib vaja minna korduvaid annuseid või kauakestvaid vektoreid. Kokkuvõttes tähendab nende leidude tõlkimine glaukoomiraviks kroonilise kahjustuse dünaamika kohandamist ja ravide ohutuse ning pikaajalise toime tagamist.

Kokkuvõte

Geeniteraapia, mis moduleerib RGC sisemisi teid, näitab põnevat potentsiaali: närilistel suudab see nägemisnärvi taastada ja isegi osa nägemist taastada. Peamised strateegiad, nagu PTEN/mTOR aktiveerimine, KLF4 deletsioon või Sox11 üleekspressioon, annavad igaüks regenereeriva tõuke läbi erinevate rakuprogrammide. Hiirte uuringud kinnitavad, et aksonid suudavad aju uuesti innerveerida ja parandada lihtsaid nägemisülesandeid (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Siiski tuleb lahendada ohutusprobleemid (onkogeneetiline risk, rakkude kadu, immuunreaktsioon) ja täiustada manustamismeetodeid. AAV vektorite ja silmasüstide areng pakub vahendeid RGC-de tõhusaks sihtimiseks (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Järgmised sammud hõlmavad testimist kroonilistes glaukoomimudelites, annustamise ja promootorite optimeerimist ning geeniteraapia kombineerimist glaukoomiraviga. Kokkuvõttes toetab prekliiniline tõendusmaterjal tugevalt edasist arengut: sisemiste kasvuteede hoolika häälestamise abil võime põhimõtteliselt muuta nägemisnärvi taastamise väljavaateid.