Introduktion

Synstab som følge af skade på synsnerven eller glaukom opstår, fordi retinale ganglieceller (RGC'er) ikke formår at genudvikle deres aksoner. Hos voksne pattedyr er RGC'ernes indre vækstprogram normalt slået fra, så beskadigede nerver ikke heler af sig selv (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nylige museundersøgelser viser, at gentherapi kan reaktivere disse vækstveje. For eksempel, at slette PTEN-genet (en bremse på cellevækst) i voksne RGC'er tænder for mTOR-vækstvejen og fører til stærk aksonregenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I denne artikel gennemgår vi, hvordan manipulation af PTEN/mTOR, KLF-familiegener og Sox11 kan stimulere RGC-aksonregenerering, hvad dette har opnået i mus, sikkerhedsproblemerne (som kræftrisiko), hvordan gener leveres (AAV virale vektorer, intravitreal eller suprakoroidal injektion), og hvilke skridt der er nødvendige for at bevæge sig fra akutte skademodeller til kronisk glaukombehandling.

Indre vækstveje i RGC'er

PTEN/mTOR-vej

Under normale forhold holder voksne RGC'er mTOR-vejen stort set inaktiv, hvilket begrænser deres evne til at vokse nye aksoner (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN er et gen, der hæmmer mTOR. Forskere fandt, at fjernelse af PTEN i voksne muse-RGC'er frigiver mTOR-signalering og muliggør aksonregenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). I et banebrydende studie førte konditionel knockout af PTEN i voksne mus til robust synsnervens regeneration (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Omkring 8-10 % af de overlevende RGC'er udvidede aksoner mere end 0,5 mm forbi skaden, hvor nogle aksoner voksede over 3 mm og endda nåede synsnervekrydsningen (chiasma opticum) 4 uger efter skaden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). At slå en anden bremse på mTOR, TSC1-genet, ud inducerede også aksonregenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Sletning af PTEN stimulerede ikke kun genvækst, men forbedrede også RGC-overlevelse (ca. 45 % overlevelse mod ~20 % i kontroller) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Der er dog en sikkerhedsbekymring: PTEN er en tumorsuppressor. Langvarigt tab af PTEN kan fremme ukontrolleret cellevækst. Faktisk bemærkede en stor regenereringsundersøgelse, at permanent sletning af PTEN ville være klinisk uacceptabelt på grund af kræftrisiko (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). For at adressere dette foreslår forskere at bruge kontrollerbar gentherapi (for eksempel AAV-leveret shRNA under en omskiftelig promotor), så PTEN-aktiviteten kan slås fra under genvækst og derefter tændes igen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kort sagt er PTEN/mTOR en kraftfuld intern vækstkontakt, men den skal kontrolleres omhyggeligt.

KLF-familien og Sox11

Forskere har også målrettet transkriptionsfaktorer, der kontrollerer aksonvækst. Krüppel-lignende faktorer (KLF'er) er en familie af sådanne gener. Et centralt fund er, at KLF4 fungerer som en bremse på aksonvækst: RGC'er uden KLF4 vokser bedre end normalt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Hos mus, hvor RGC'er er konstrueret uden KLF4, udvidede disse neuroner meget længere neuritter i kultur, og efter optisk nerveknusning voksede mange flere aksoner ud. For eksempel, to uger efter skaden, havde KLF4-knockout-mus signifikant flere regenererende fibre ud over 1 mm fra knusningsstedet end vildtype-mus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andre KLF'er har forskellige roller: nogle (som KLF6 og KLF7) fremmer vækst, mens andre (som KLF9) undertrykker den (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Således kan en rebalancering af KLF-ekspression fjerne nogle af de udviklingsmæssige “bremser” på RGC-vækst (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

En anden transkriptionsfaktor er Sox11, vigtig i udviklingen. Overekspression af Sox11 i voksne RGC'er (ved brug af AAV-genlevering) viste sig også at øge regeneration. I et studie viste RGC'er med ekstra Sox11 en markant stigning i aksonregenerering efter skade (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Sox11 har dog blandede effekter: den fremmer genvækst i visse RGC-typer, men kan dræbe andre. Især dræbte Sox11-overekspression næsten alle de såkaldte “alpha” RGC'er (en undertype af RGC), som normalt reagerer godt på PTEN-baserede behandlinger (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Med andre ord omprogrammerer Sox11 nogle RGC'er til en vækstkompetent tilstand, men det skader også andre (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Forskere konkluderer, at forskellige RGC-subtyper kræver forskellige genvækststrategier.

Nøglemusestudier af optisk nerveknusning

Musemodeller af synsnerveskade (knusning af synsnerven) har vist, hvordan disse genmanipulationer fungerer i praksis. En klassisk tilgang kombinerede veje for maksimal effekt. I et PNAS-studie anvendte forskere tre behandlinger: sletning af PTEN, induktion af inflammation i øjet (zymosan) og forhøjelse af cAMP. Denne trio fik RGC'er til at genudvikle aksoner hele vejen gennem synsnerven og ind i hjernens visuelle centre (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Da de undersøgte hjernerne hos behandlede mus, nåede mange regenererende fibre nucleus geniculatus lateralis, colliculus superior og andre visuelle områder (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vigtigt er, at denne genvækst førte til delvis genopretning af synsrelateret adfærd. Behandlede mus genvandt en vis evne til at udføre simple visuelle opgaver: de kunne spore bevægelige mønstre (en optomotorisk refleks) og vurdere dybde bedre end skadede kontrolmus (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (De viste endda bedre cirkadiske lysresponser [20†L33-L38], selvom disse detaljer kan være svære at måle.) Dette arbejde demonstrerede, at langdistance aksonregenerering hos voksne mus funktionelt kan genforbinde dele af synssystemet.

Andre studier fokuserede på individuelle faktorer. Intravitreal levering af en AAV, der bærer en konstitutivt aktiv TrkB (en hjerneafledt neurotrofisk faktorreceptor), forårsagede endnu længere vækst. For eksempel brugte Nishijima et al. en modificeret TrkB (kaldet F-iTrkB) leveret af AAV og observerede, at aksoner voksede mere end 4,5 mm, hvoraf nogle nåede synsnervekrydsningen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tilsvarende førte indførelse af et vækstfremmende gen som aktiv K-Ras (et velkendt onkogen) i RGC'er til omkring 3 mm regeneration (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Interessant nok blev der ikke observeret tumorer i de behandlede øjne, men forfatterne anbefaler stadig at bruge inducerbare on/off-genkontakter af sikkerhedsmæssige årsager (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Disse og andre studier bekræfter, at aktivering af indre vækstgener faktisk kan drive regeneration i musemodeller for synsnerveskade.

Delvis synsgenopretning

Museeksperimenterne sporede ofte ikke kun anatomi, men også funktion. Den optomotoriske refleks (mus, der følger bevægelige striber) og dybdeopfattelsestests er simple måder at se, om synet forbedres. I tredobbelt-behandlingsstudiet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) viste musene delvis genopretning af disse reflekser. De kunne igen reagere på bevægelige visuelle stimuli og vurdere dybde, hvorimod skadede mus uden behandling ikke kunne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette er opmuntrende: det betyder, at de genvoksede aksoner dannede nyttige forbindelser. Genopretningen var dog kun delvis. Mange visuelle veje (især fin billeddannende syn) forbliver afbrudte. Indtil videre har regeneration genoprettet grundlæggende visuelle reaktioner, men ikke fuldt syn. Alligevel bekræfter enhver funktionel gevinst potentialet i disse strategier.

Sikkerhedsovervejelser

Selvom gentherapi for regeneration er lovende, er sikkerhed en kritisk bekymring. De samme vækstveje, der hjælper aksoner, kan også forårsage problemer, hvis de ikke kontrolleres. Som nævnt er permanent sletning af PTEN en kræftrisiko (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ligeledes kan kronisk aktivering af mTOR føre til tumorvækst (f.eks. udvikler TSC1/2-patienter tumorer). Genterapier, der fremmer vækstfaktorer (som modificeret RAS eller andre onkogener), skal kontrolleres omhyggeligt. Især blev der i eksperimentel AAV-RAS-terapi ikke observeret tumorer i museøjne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), men forfatterne understreger brugen af regulerede (inducerbare) systemer i tilfælde af, at onkogen aktivitet skal slås fra (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Andre sikkerhedsproblemer omfatter celledød og immunreaktioner. Nogle interventioner skader visse celler: for eksempel dræbte Sox11-overekspression mange alpha-type RGC'er (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Enhver terapi, der dræber RGC'er, ophæver dens fordel. Der er også risiko for skade fra injektioner eller inflammation. At inducere inflammation (zymosan) hjalp regeneration hos mus, men hos mennesker ville det være farligt. Langtidseffekter af AAV-inserts (som insertionsmutagenese) er lave, men enhver okulær gentherapi kræver omhyggelig vurdering. Kort sagt skal hvert vækstfremmende gen afbalanceres mod potentiel skade: ideelt set leveret forbigående eller under streng kontrol.

Genleveringsstrategier

At få gener ind i de rigtige celler er en nøgleudfordring. For RGC'er er adeno-associerede vira (AAV'er) de foretrukne vektorer. AAV'er er sikre, ikke-replikerende vira, der kan bære terapeutiske gener ind i retinale celler. En almindelig metode er intravitreal injektion: at injicere AAV direkte ind i øjets glaslegeme. AAV2 er den klassiske serotype for retinal transduktion; den når effektivt RGC'er, når den injiceres intravitrealt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Faktisk fandt et studie, at intravitreal AAV2 transducerede over 90% af RGC'er (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Andre kapsider kan også bruges. For eksempel viser AAV6, der gives intravitrealt, meget høj tropisme for den indre nethinde og RGC-laget (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Forskere ingeniører også AAV2-varianter (som mutationer eller kimærer) for at krydse nethindebarierer endnu bedre, men disse detaljer er under udvikling.

En anden rute er suprakoroidal injektion, hvor en nål eller mikrokanüle leverer AAV mellem sclera og choroidea (det vaskulære lag). Denne tilgang spreder vektoren bredt under nethinden. Suprakoroidal AAV8 i aber resulterede i bred genekspression (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Det kan gøres med specialdesignede mikronåle. Suprakoroidal levering undgår større kirurgi, men er stadig invasiv og kan forårsage lokal inflammation. Faktisk forårsagede suprakoroidal AAV8 mild chorioretinitis (inflammation af choroidea), der krævede steroider, selvom det aftog over uger (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vigtigt er, at suprakoroidal levering udløste svagere systemiske antistofresponser mod AAV-kapsiden end intravitreal levering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette skyldes sandsynligvis, at noget virus undslipper øjet forskelligt. Overordnet set viser suprakoroidal injektion løfte for gentherapi til den bageste del af øjet, men dens immunologiske effekter kræver håndtering.

Immunogenicitet

Selvom øjet til en vis grad er “immunologisk privilegeret,” kan AAV-genlevering stadig fremprovokere immunreaktioner. Intravitreal AAV lækker ofte ud af øjet gennem drænkanaler. Et studie i primater fandt, at intravitreal AAV resulterede i ~400–500 gange mere virus i blodbanen sammenlignet med subretinal injektion (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette forårsagede en meget stærk antistofrespons mod AAV-kapsiden (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Derimod er subretinal AAV (injiceret under nethinden) sekvestreret i øjet og fremkalder typisk næsten ingen anti-kapsid-antistoffer (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Suprakoroidal AAV ligger midt imellem: noget virus forbliver i øjet, mens noget når nærliggende væv. Studier viser, at suprakoroidal AAV forårsager mildere anti-kapsid antistofproduktion end intravitreal (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), men det kan anspore immunceller mod genproduktet (som set med GFP), fordi det transducerer celler uden for blod-retinal-barrieren (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Ud over antistoffer kan T-celleresponser angribe transducerede celler. Hvis det indsatte gen producerer et protein, som kroppen opfatter som fremmed (som GFP i eksperimenter), kan immunceller fjerne disse celler. Selv ægte menneskelige gener kan undertiden udløse lavgradig inflammation. Kliniske retinale genterapiforsøg (f.eks. for RPE65) giver ofte steroider for at dæmpe denne respons. Ruter, der forbliver inden for nethinden (subretinal, suprakoroidal), har en tendens til at være mindre immunogene generelt end glaslegeme-injektioner (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Fremtidige terapier skal afbalancere effektiv levering med minimal immunaktivering, muligvis ved brug af nyere AAV-typer eller immunsuppressive regimer.

Overførsel til glaukombehandling

Glaukom udgør en anderledes udfordring end en akut nerveknusning. Ved glaukom dør RGC'er langsomt på grund af faktorer som højt øjentryk, nedsat blodgennemstrømning og stress. For at behandle glaukom skal gentherapi fungere i en kronisk skadesindstilling. Dette betyder, at timing er vigtig: terapier kan være nødvendige at give tidligt for at beskytte RGC'er, eller periodisk for at justere vækstsignaler. Heldigvis er der nu arbejde i gang med at bygge bro over dette gab. I et nyligt studie brugte forskere AAV til at levere en altid-aktiv TrkB-receptor (F-iTrkB) ind i øjnene på glaukom-modelmus. Disse mus viste både beskyttelse af RGC'er og betydelig aksonregenerering (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dette tyder på, at selv under glaukomatøse forhold kan aktivering af vækstveje hjælpe.

Men at bevæge sig fra knusningsmodeller til human glaukom vil kræve flere skridt. Vi er nødt til at teste disse genterapier i dyreglaukommodeller (som induceret okulær hypertension eller genetiske modeller) snarere end kun i knusningsmodeller. Vi skal også overveje aldring og det syge miljø: ældre neuroner, arvæv og fluktuerende øjentryk. Det vil sandsynligvis være nødvendigt at kombinere gentherapi med standard glaukombehandling (tryksænkning, brug af neurotrofiske faktorer) og at anvende kontrollerede gensystemer. For eksempel, som nævnt, kunne AAV-konstruktioner bruge inducerbare promotorer, så vækstfaktor-genet kan slås fra, efter at aksoner er vokset ud igen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Fordi human glaukom udvikler sig langsomt, er en enkelt geninjektion muligvis ikke nok; gentagen dosering eller langvarige vektorer kan være nødvendige. Sammenfattende vil oversættelse af disse fund til glaukomterapi betyde justering for kroniske skadesdynamikker og sikring af, at behandlinger er sikre og holdbare.

Konklusion

Gentherapi, der modulerer RGC's intrinsikke veje, viser spændende potentiale: hos gnavere kan den få synsnerven til at vokse tilbage og endda genoprette noget syn. Nøglestrategier som PTEN/mTOR-aktivering, KLF4-sletning eller Sox11-overekspression giver hver regenererende boosts gennem forskellige celleprogrammer. Musestudier bekræfter, at aksoner kan reinnervate hjernen og forbedre simple visuelle opgaver (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dog skal sikkerhedsspørgsmål (onkogen risiko, celletab, immunrespons) løses, og leveringsmetoder forfines. Fremskridt inden for AAV-vektorer og okulære injektioner giver værktøjer til at målrette RGC'er effektivt (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Næste skridt omfatter test i kroniske glaukommodeller, optimering af dosering og promotorer samt kombination af gentherapi med glaukombehandlinger. Samlet set understøtter den prækliniske evidens kraftigt yderligere udvikling: ved omhyggeligt at justere intrinsikke vækstveje kan vi fundamentalt ændre udsigterne for reparation af synsnerven.