Введение

Потеря зрения в результате повреждения зрительного нерва или глаукомы происходит из-за неспособности ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) восстанавливать свои аксоны. У взрослых млекопитающих программа внутреннего роста ГКС обычно отключена, поэтому поврежденные нервы не заживают самостоятельно (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Недавние исследования на мышах показывают, что генная терапия может реактивировать эти пути роста. Например, удаление гена PTEN (ингибитора клеточного роста) в ГКС взрослых особей включает путь роста mTOR и приводит к сильной регенерации аксонов (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). В этой статье мы рассмотрим, как манипулирование PTEN/mTOR, генами семейства KLF и Sox11 может стимулировать регенерацию аксонов ГКС, чего это достигло на мышах, вопросы безопасности (например, риск рака), способы доставки генов (вирусные векторы AAV, интравитреальные или супрахориоидальные инъекции) и какие шаги необходимы для перехода от моделей острого повреждения к лечению хронической глаукомы.

Внутренние пути роста в ГКС

Путь PTEN/mTOR

В нормальных условиях ГКС взрослых особей держат путь mTOR преимущественно отключенным, что ограничивает их способность к росту новых аксонов (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN — это ген, который ингибирует mTOR. Ученые обнаружили, что удаление PTEN в ГКС взрослых мышей высвобождает сигнализацию mTOR и позволяет аксонам регенерировать (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). В одном знаменательном исследовании условный нокаут PTEN у взрослых мышей привел к интенсивной регенерации зрительного нерва (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Около 8–10% выживших ГКС удлиняли аксоны более чем на 0,5 мм за пределы повреждения, при этом некоторые аксоны вырастали более чем на 3 мм и даже достигали зрительного перекреста через 4 недели после травмы (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Нокаут другого ингибитора mTOR, гена TSC1, также индуцировал регенерацию аксонов (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Удаление PTEN не только стимулировало регенерацию, но и улучшило выживаемость ГКС (около 45% выживаемости по сравнению с ~20% в контроле) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Однако существует проблема безопасности: PTEN является супрессором опухолей. Долгосрочная потеря PTEN может способствовать неконтролируемому росту клеток. Действительно, в одном крупном исследовании по регенерации отмечалось, что постоянное удаление PTEN было бы клинически неприемлемым из-за риска рака (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Для решения этой проблемы исследователи предлагают использовать управляемую генную терапию (например, shRNA, доставляемую AAV под переключаемым промотором), чтобы активность PTEN можно было отключать во время регенерации, а затем снова включать (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Короче говоря, PTEN/mTOR является мощным внутренним переключателем роста, но его необходимо тщательно контролировать.

Семейство KLF и Sox11

Исследователи также нацелились на факторы транскрипции, которые контролируют рост аксонов. Факторы, подобные Krüppel (KLF), представляют собой семейство таких генов. Ключевое открытие заключается в том, что KLF4 действует как тормоз роста аксонов: ГКС, лишенные KLF4, растут лучше, чем обычно (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). У мышей, генетически модифицированных так, что их ГКС не имеют KLF4, эти нейроны удлиняли гораздо более длинные нейриты в культуре и, после раздавливания зрительного нерва, выросло гораздо больше аксонов. Например, через две недели после травмы у мышей с нокаутом KLF4 было значительно больше регенерирующих волокон на расстоянии более 1 мм от места раздавливания, чем у мышей дикого типа (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Другие KLF играют различные роли: некоторые (например, KLF6 и KLF7) способствуют росту, в то время как другие (например, KLF9) его подавляют (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Таким образом, перебалансировка экспрессии KLF может снять некоторые из “тормозов” развития роста ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Другим фактором транскрипции является Sox11, важный в развитии. Было также обнаружено, что сверхэкспрессия Sox11 в ГКС взрослых особей (с использованием доставки гена AAV) способствует регенерации. В одном исследовании ГКС с дополнительным Sox11 показали заметное увеличение регенерации аксонов после травмы (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Однако Sox11 имеет смешанные эффекты: он способствует регенерации у определенных типов ГКС, но может убивать другие. Примечательно, что сверхэкспрессия Sox11 уничтожила почти все так называемые “альфа” ГКС (подтип ГКС), которые обычно хорошо реагируют на лечение на основе PTEN (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Другими словами, Sox11 перепрограммирует некоторые ГКС в состояние, способное к росту, но также вредит другим (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ученые приходят к выводу, что различные подтипы ГКС требуют различных стратегий регенерации.

Ключевые исследования раздавливания зрительного нерва у мышей

Мышиные модели повреждения зрительного нерва (раздавливание зрительного нерва) показали, как эти генные манипуляции работают на практике. Классический подход сочетал пути для максимального эффекта. В одном исследовании PNAS ученые применили три метода лечения: удаление PTEN, индукцию воспаления в глазу (зимозан) и повышение уровня цАМФ. Это трио стимулировало ГКС к регенерации аксонов по всему зрительному нерву и в зрительные центры мозга (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Когда они исследовали мозг леченных мышей, многие регенерирующие волокна достигали латерального коленчатого ядра, верхнего бугорка четверохолмия и других зрительных областей (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Важно отметить, что эта регенерация привела к частичному восстановлению поведенческих реакций, связанных со зрением. Леченные мыши восстановили некоторую способность выполнять простые зрительные задачи: они могли отслеживать движущиеся паттерны (оптомоторный рефлекс) и лучше оценивать глубину, чем контрольные группы с травмой (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Они даже демонстрировали лучшую циркадную реакцию на свет [20†L33-L38], хотя эти детали трудно измерить.) Эта работа продемонстрировала, что дистанционная регенерация аксонов у взрослых мышей может функционально восстанавливать части зрительной системы.

Другие исследования были сосредоточены на отдельных факторах. Интравитреальная доставка AAV, несущего конститутивно активный TrkB (рецептор нейротрофического фактора мозга), приводила к еще более значительному росту. Например, Nishijima и соавторы использовали модифицированный TrkB (называемый F-iTrkB), доставленный AAV, и наблюдали регенерацию аксонов на расстояние более 4,5 мм, при этом некоторые достигали зрительного перекреста (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Аналогично, введение стимулирующего рост гена, такого как активный K-Ras (известный онкоген), в ГКС приводило к регенерации около 3 мм (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Интересно, что опухолей в глазах, подвергшихся лечению, не наблюдалось, но авторы все же рекомендуют использовать индуцируемые переключатели включения/выключения генов для безопасности (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Эти и другие исследования подтверждают, что активация внутренних генов роста действительно может стимулировать регенерацию в моделях повреждения зрительного нерва у мышей.

Частичное восстановление зрения

Эксперименты на мышах часто отслеживали не только анатомию, но и функцию. Оптомоторный рефлекс (мыши, следующие за движущимися полосами) и тесты на восприятие глубины — это простые способы оценить улучшение зрения. В исследовании с тройным лечением (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) мыши продемонстрировали частичное восстановление этих рефлексов. Они снова могли реагировать на движущиеся изображения и оценивать глубину, в то время как травмированные мыши без лечения не могли (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Это обнадеживает: это означает, что регенерировавшие аксоны образовали полезные связи. Однако восстановление было лишь частичным. Многие зрительные пути (особенно тонкое образное зрение) остаются разъединенными. До сих пор регенерация восстанавливала основные зрительные реакции, но не полное зрение. Тем не менее, любое функциональное улучшение подтверждает потенциал этих стратегий.

Соображения безопасности

Хотя генная терапия для регенерации является многообещающей, безопасность вызывает серьезную озабоченность. Те же пути роста, которые помогают аксонам, также могут вызывать проблемы, если их не контролировать. Как уже отмечалось, постоянное удаление PTEN сопряжено с риском развития рака (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Аналогично, хроническая активация mTOR может привести к росту опухолей (например, у пациентов с TSC1/2 развиваются опухоли). Генная терапия, стимулирующая факторы роста (такие как модифицированный RAS или другие онкогены), должна тщательно контролироваться. Примечательно, что в экспериментальной AAV-RAS терапии опухолей в глазах мышей не наблюдалось (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), но авторы подчеркивают необходимость использования регулируемых (индуцируемых) систем на случай, если какую-либо онкогенную активность потребуется отключить (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Другие проблемы безопасности включают гибель клеток и иммунные реакции. Некоторые вмешательства наносят вред определенным клеткам: например, сверхэкспрессия Sox11 убила многие альфа-тип ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Любая терапия, убивающая ГКС, нивелирует ее пользу. Также существует риск повреждения от инъекций или воспаления. Индукция воспаления (зимозан) способствовала регенерации у мышей, но у людей это было бы опасно. Долгосрочные эффекты вставок AAV (такие как инсерционный мутагенез) низки, но любая глазная генная терапия требует тщательной оценки. Короче говоря, каждый ген, способствующий росту, должен быть сбалансирован с потенциальным вредом: в идеале доставляться временно или под строгим контролем.

Стратегии доставки генов

Введение генов в нужные клетки — ключевая задача. Для ГКС аденоассоциированные вирусы (AAV) являются основными векторами. AAV — это безопасные, нереплицирующиеся вирусы, которые могут доставлять терапевтические гены в клетки сетчатки. Распространенный метод — интравитреальная инъекция: введение AAV непосредственно в стекловидное тело глаза. AAV2 является классическим серотипом для трансдукции сетчатки; он эффективно достигает ГКС при интравитреальном введении (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Фактически, одно исследование показало, что интравитреальный AAV2 трансдуцировал более 90% ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Могут использоваться и другие капсиды. Например, AAV6 при интравитреальном введении демонстрирует очень высокий тропизм к внутренней сетчатке и слою ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ученые также разрабатывают варианты AAV2 (такие как мутации или химеры) для еще лучшего преодоления ретинальных барьеров, но эти детали постоянно развиваются.

Другой путь — супрахориоидальная инъекция, при которой игла или микроканюля доставляет AAV между склерой и хориоидеей (сосудистой оболочкой). Этот подход широко распространяет вектор под сетчаткой. Супрахориоидальный AAV8 у обезьян привел к широкой экспрессии генов (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Это может быть сделано с помощью специально разработанных микроигл. Супрахориоидальная доставка позволяет избежать серьезных операций, но все же является инвазивной и может вызывать местное воспаление. Фактически, супрахориоидальный AAV8 вызвал легкий хориоретинит (воспаление хориоидеи), который потребовал стероидов, хотя и разрешился в течение нескольких недель (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Важно отметить, что супрахориоидальная доставка вызывала более слабые системные антитела к капсиду AAV, чем интравитреальная доставка (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Вероятно, это связано с тем, что часть вируса покидает глаз по-другому. В целом, супрахориоидальная инъекция демонстрирует многообещающие результаты для генной терапии заднего отдела глаза, но ее иммунные эффекты требуют управления.

Иммуногенность

Несмотря на то, что глаз до некоторой степени «иммунопривилегирован», доставка генов с помощью AAV все же может провоцировать иммунные реакции. Интравитреальный AAV часто просачивается из глаза через дренажные каналы. Одно исследование на приматах показало, что интравитреальный AAV приводил к примерно в 400–500 раз большему количеству вируса в кровотоке по сравнению с субретинальной инъекцией (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Это вызывало очень сильный антительный ответ против капсида AAV (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Напротив, субретинальный AAV (введенный под сетчатку) изолируется в глазу и обычно вызывает почти полное отсутствие антител к капсиду (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Супрахориоидальный AAV находится посередине: часть вируса остается в глазу, в то время как часть достигает близлежащих тканей. Исследования показывают, что супрахориоидальный AAV вызывает более умеренное образование антител к капсиду, чем интравитреальный (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), но он может стимулировать иммунные клетки против генного продукта (как видно на примере GFP), потому что он трансдуцирует клетки за пределами гематоретинального барьера (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Помимо антител, Т-клеточные реакции могут атаковать трансдуцированные клетки. Если вставленный ген производит белок, который организм воспринимает как чужеродный (как GFP в экспериментах), иммунные клетки могут уничтожить эти клетки. Даже настоящие человеческие гены иногда могут вызывать низкоуровневое воспаление. Клинические испытания генной терапии сетчатки (например, для RPE65) часто включают назначение стероидов для подавления этой реакции. Пути, которые остаются в пределах сетчатки (субретинальный, супрахориоидальный), как правило, менее иммуногенны в целом, чем инъекции в стекловидное тело (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Будущие методы лечения должны будут найти баланс между эффективной доставкой и минимальной иммунной активацией, возможно, с использованием более новых типов AAV или иммуносупрессивных режимов.

Переход к лечению глаукомы

Глаукома представляет собой иную проблему, чем острое раздавливание нерва. При глаукоме ГКС медленно отмирают из-за таких факторов, как высокое внутриглазное давление, снижение кровотока и стресс. Для лечения глаукомы генная терапия должна работать в условиях хронического повреждения. Это означает, что важен выбор времени: терапия может потребоваться на ранних стадиях для защиты ГКС или периодически для повторной настройки сигналов роста. К счастью, некоторые работы начинают преодолевать этот разрыв. В недавнем исследовании ученые использовали AAV для доставки постоянно активного рецептора TrkB (F-iTrkB) в глаза мышей с моделью глаукомы. Эти мыши продемонстрировали как защиту ГКС, так и значительную регенерацию аксонов (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Это говорит о том, что даже в условиях глаукомы активация путей роста может помочь.

Тем не менее, переход от моделей раздавливания к человеческой глаукоме потребует дополнительных шагов. Нам необходимо протестировать эти генные терапии на животных моделях глаукомы (таких как индуцированная офтальмогипертензия или генетические модели), а не только на моделях раздавливания. Мы также должны учитывать старение и болезненную среду: старые нейроны, рубцовую ткань и колеблющееся глазное давление. Вероятно, потребуется сочетать генную терапию со стандартным лечением глаукомы (снижение давления, использование нейротрофических факторов) и использовать контролируемые генные системы. Например, как отмечалось, конструкции AAV могут использовать индуцируемые промоторы, чтобы ген фактора роста можно было отключать после регенерации аксонов (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Поскольку глаукома у человека прогрессирует медленно, одной генной инъекции может быть недостаточно; может потребоваться повторное введение или использование долгосрочных векторов. Таким образом, перенос этих открытий в терапию глаукомы будет означать адаптацию к динамике хронического повреждения и обеспечение безопасности и долговечности лечения.

Заключение

Генная терапия, модулирующая внутренние пути ГКС, демонстрирует многообещающий потенциал: у грызунов она может способствовать регенерации зрительного нерва и даже восстанавливать некоторое зрение. Ключевые стратегии, такие как активация PTEN/mTOR, удаление KLF4 или сверхэкспрессия Sox11, каждая по-своему стимулирует регенерацию через различные клеточные программы. Исследования на мышах подтверждают, что аксоны могут повторно иннервировать мозг и улучшать выполнение простых зрительных задач (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Однако необходимо решить проблемы безопасности (онкогенный риск, потеря клеток, иммунный ответ) и усовершенствовать методы доставки. Прогресс в области векторов AAV и глазных инъекций предоставляет инструменты для эффективного воздействия на ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Следующие шаги включают тестирование на моделях хронической глаукомы, оптимизацию дозировки и промоторов, а также сочетание генной терапии с лечением глаукомы. В целом, доклинические данные убедительно подтверждают дальнейшее развитие: путем тщательной настройки внутренних путей роста мы можем фундаментально изменить перспективы восстановления зрительного нерва.