Wprowadzenie

Jaskra jest główną przyczyną nieodwracalnej ślepoty na całym świecie, ponieważ komórki zwojowe siatkówki (RGC), które łączą oko z mózgiem, obumierają i nie mogą się regenerować (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bez RGC sygnały wzrokowe z siatkówki nie mogą dotrzeć do ośrodków mózgowych (takich jak ciało kolankowate boczne i wzgórek górny), co prowadzi do utraty wzroku. Obecne metody leczenia jaskry (np. obniżanie ciśnienia śródgałkowego) mogą chronić ocalałe RGC, ale nie mogą przywrócić tych, które już zostały utracone (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Terapia komórkami macierzystymi ma na celu zastąpienie utraconych RGC poprzez różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (zarówno embrionalnych komórek macierzystych, ESC, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, iPSC) w RGC i przeszczepianie ich do oka (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). W zasadzie mogłoby to stanowić nieograniczone źródło neuronów siatkówki (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jednak realizacja tej wizji wymaga pokonania ogromnych wyzwań: nowe RGC muszą przeżyć, wyhodować aksony przez wyjście z oka (blaszkę sitową) do nerwu wzrokowego, przebyć długie dystanse do precyzyjnych celów w mózgu, utworzyć funkcjonalne synapsy i ulec mielinizacji – wszystko to w hamującym środowisku dorosłego ośrodkowego układu nerwowego.

Niniejszy artykuł przedstawia stan wiedzy na temat pozyskiwania RGC z ludzkich komórek macierzystych i ich przeszczepiania w modelach zwierzęcych. Następnie omawiamy krytyczne bariery dla sukcesu – wydłużenie aksonu przez blaszkę sitową, kierowanie do celów wzgórzowych i wzgórkowych, tworzenie synaps i mielinizację – a także kwestie bezpieczeństwa (odrzucenie immunologiczne, ryzyko guza) oraz metody dostarczania (wstrzyknięcie doszklistkowe a podsiatkówkowe). Na koniec przedstawiamy realistyczną prognozę, kiedy „pierwsze próby na ludziach” w jaskrze mogą być wykonalne i jakie miary wyników będą wymagały. Przez cały czas dążymy do jasności: kluczowe terminy są pogrubione, a wszelkie pojęcia techniczne są wyjaśniane dla szerokiej publiczności.

Różnicowanie RGC z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Naukowcy opracowali wiele protokołów, aby przekształcić ludzkie ESC lub iPSC w neurony podobne do RGC. Zazwyczaj komórki macierzyste są najpierw kierowane do stanu progenitorowego siatkówki za pomocą kombinacji czynników wzrostu i małych cząsteczek, które naśladują rozwój oka (na przykład modulatory szlaków FGF, IGF, BMP, Wnt i Notch) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). W odpowiednich warunkach komórki te dalej różnicują się w RGC, co można potwierdzić za pomocą markerów RGC. Kluczowe markery to czynniki transkrypcyjne BRN3B (POU4F2) i ISL1, białko wiążące RNA RBPMS, neuronalne białko cytoszkieletowe β-III tubulina (TUJ1) oraz synukleina-γ (SNCG). Rzeczywiście, jedno badanie wykazało, że kultury pochodzące z PSC wyrażały wiele markerów RGC: „czynniki transkrypcyjne, takie jak BRN3, ISL1 i SNCG”, pojawiły się obok długich neurytów, potwierdzając tożsamość RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Te RGC pochodzące z komórek macierzystych przypominają swoje naturalne odpowiedniki pod względem ekspresji genów i morfologii, wykazując długie wypustki i generując potencjały czynnościowe.

RGC nie są jednolitym typem komórek. Istnieją dziesiątki podtypów RGC (np. komórki czułe na ruch kierunkowo-selektywne, komórki o centrum on/off, wewnętrznie fotoczułe komórki melanopsynowe, alfa-RGC itp.), z których każdy ma odrębne funkcje (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Badania na zwierzętach skatalogowały ponad 30 podtypów RGC na podstawie anatomii i markerów molekularnych (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), a dowody sugerują, że ludzie posiadają około 20 lub więcej podtypów o unikalnych połączeniach (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teoretycznie protokoły komórek macierzystych można by dostosować do produkcji specyficznych podtypów poprzez regulację sygnałów rozwojowych. W praktyce większość obecnych metod dąży do uzyskania mieszanej populacji RGC. Następnie naukowcy weryfikują różnorodność podtypów, współbarwiąc kombinacje markerów: na przykład jedno badanie różnicowania ludzkich RGC zidentyfikowało wśród swoich komórek BRN3+ kandydatów na RGC kierunkowo-selektywne typu on-off (ekspresjonujące CART) i alfa-RGC (ekspresjonujące SPP1/osteopontynę) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Optymalizacja specyfikacji podtypów jest aktywnym obszarem badań, ponieważ każdy podtyp RGC (z własnymi przed- i po-synaptycznymi partnerami) będzie wymagał odpowiedniej integracji in vivo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Wydajność i szybkość generowania RGC poprawiły się. Wczesne protokoły trwały kilka tygodni lub miesięcy, ale nowsze metody przyspieszają ten proces. Na przykład Luo i wsp. zaprojektowali nadekspresję czynnika transkrypcyjnego NGN2 plus medium neurotroficzne, aby wytworzyć neurony podobne do RGC w zaledwie dwa tygodnie, w porównaniu do 1–2 miesięcy we wcześniejszych kulturach 2D lub 3D (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Komórki te ekspresjonowały markery RGC i, po przeszczepieniu do oczu dorosłych szczurów, „pomyślnie migrowały do warstwy komórek zwojowych w ciągu 1 tygodnia” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Podobnie, pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane jako 3D organoidy siatkówki (które odtwarzają rozwój oka) naturalnie wytwarzają RGC wraz z innymi neuronami siatkówki. RGC pochodzące z organoidów mają tendencję do posiadania profili ekspresji genów bliższych płodowym RGC niż kultury 2D, a wiele grup obecnie pozyskuje komórki wzbogacone w RGC z organoidów do eksperymentów transplantacyjnych (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Pomimo tych postępów, wydajność pozostaje skromna, a kultury są niejednorodne. Protokoły często wytwarzają mieszaną populację komórek siatkówki z mniejszością RGC, a przeżywalność w kulturze może być ograniczona (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Naukowcy zazwyczaj stosują sortowanie komórek (np. reportery Thy1 lub BRN3) w celu oczyszczenia RGC przed przeszczepem. Głównym celem jest osiągnięcie bardzo wysokiej czystości, ponieważ każda niezróżnicowana lub niecelowa komórka niesie ryzyko tworzenia guzów. Niedawne badanie ostrzegło, że „dla badań translacyjnych kluczowe będzie określenie czystości dawcy RGC w celu zmniejszenia ryzyka powstawania potworniaków” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Przeszczepy w modelach zwierzęcych: przeżywalność i integracja

Wiele badań przedklinicznych testowało ludzkie RGC pochodzące z komórek macierzystych w modelach zwierzęcych. Cele obejmują wykazanie, że przeszczepione RGC mogą przeżyć, zintegrować się z siatkówką gospodarza, wytworzyć aksony i (ostatecznie) przekazywać sygnały. Eksperymenty przeprowadzono głównie na gryzoniach (myszach, szczurach), ale także na większych zwierzętach (kotach) i naczelnych innych niż ludzie.

Po różnicowaniu lub izolacji RGC in vitro, badacze wprowadzają je do oka gospodarza. Dwie główne strategie to wstrzyknięcie doszklistkowe (wstrzyknięcie komórek do ciała szklistego, wewnętrznej jamy oka) lub podsiatkówkowe dostarczenie (umieszczenie komórek pod siatkówką). Wyniki są różne:

- Wstrzyknięcie doszklistkowe jest technicznie proste dla celowania w RGC (które znajdują się na wewnętrznej powierzchni siatkówki). Kilka grup wstrzyknęło zawiesiny ludzkich RGC lub RGC pochodzących z organoidów siatkówki do ciała szklistego gryzoni. Na przykład Vrathasha i wsp. wstrzyknęli około 50 000 ludzkich iPSC-RGC doszklistkowo myszom WS i stwierdzili, że przeszczepione komórki zlokalizowały się w warstwie komórek zwojowych i przeżyły co najmniej pięć miesięcy po przeszczepie (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Komórki te wykształciły normalne drzewka dendrytyczne i wywołały potencjały czynnościowe wywołane światłem, niemal identyczne z natywnymi RGC myszy (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), udowadniając, że mogą funkcjonalnie zintegrować się przynajmniej w siatkówce. Luo i wsp. (2020) podobnie wykazali, że komórki podobne do RGC pochodzące z hESC (nadekspresjonujące NGN2) migrowały do warstwy zwojowej dorosłych szczurów w ciągu tygodnia (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wyniki te są zachęcające, ale liczba komórek, które rzeczywiście się integrują, jest zazwyczaj niewielka. Vrathasha zgłosiła średnio około 672 przeżywających komórek dawcy na siatkówkę myszy (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) – co stanowi niewielki ułamek normalnej liczby RGC – podkreślając trudne środowisko.

Jednym z problemów z prostymi zawiesinami doszklistkowymi jest to, że komórki często zlepiają się lub nie przylegają. W modelu uszkodzenia RGC u kotów, Becker i wsp. odkryli, że doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny komórek prowadziło do agregacji komórek i niewielkiej prawdziwej integracji (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Zauważyli, że zastosowanie rusztowania mogłoby poprawić przeżywalność i migrację w siatkówce. Rzeczywiście, niektóre badania obecnie osadzają RGC na rusztowaniach biomateriałowych lub w tkance organoidów, aby je wspierać. Na przykład ludzkie organoidy siatkówki (pozyskujące RGC w 60-70 dniu rozwoju) zostały przeszczepione podsiatkówkowo do oczu kotów. Przy systemowej immunosupresji, te przeszczepy organoidów przeżyły co najmniej 1 miesiąc i wydawały się tworzyć połączenia synaptyczne z neuronami gospodarza (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Podejście podsiatkówkowe zapewniało stały kontakt między tkanką dawcy a siatkówką, podczas gdy doszklistkowe zawiesiny komórek miały tendencję do unoszenia się lub zlepiania. Z drugiej strony, dostarczanie podsiatkówkowe jest bardziej złożoną operacją i może być ograniczone dostępną przestrzenią (przestrzeń podsiatkówkowa jest cienka u czworonogów i naczelnych).

W małych gryzoniach dostarczanie doszklistkowe pozostaje najczęściej stosowanym podejściem. Po wstrzyknięciu, udane komórki dawcy zostały zidentyfikowane jako migrujące do warstwy komórek zwojowych siatkówki gospodarza i ekspresjonujące markery RGC (BRN3, RBPMS) przez tygodnie do miesięcy (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Niektóre badania donoszą, że komórki dawcy wytwarzają nowe dendryty, a nawet początkowe pędy aksonalne w kierunku tarczy nerwu wzrokowego. Na przykład przeszczepione hiPSC-RGC u myszy wykazały rozbudowane drzewka dendrytyczne i (po stymulacji światłem) generowały postsynaptyczne potencjały, co wskazuje, że utworzyły synapsy z interneuronami dwubiegunowymi/amakrynowymi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Należy jednak zachować ostrożność: doświadczenia z przeszczepami fotoreceptorów pokazują, że przeniesione markery fluorescencyjne mogą czasami sprawiać wrażenie, że komórki przeszczepu zintegrowały się, podczas gdy w rzeczywistości jedynie przekazały barwnik komórkom gospodarza (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Potrzebne jest rygorystyczne znakowanie i testy funkcjonalne, aby potwierdzić prawdziwą integrację. We wszystkich dotychczasowych przypadkach tylko podzbiór wstrzykniętych RGC przeżywa i integruje się. Na przykład Vrathasha i wsp. wstrzyknęli 500 000 komórek, ale później policzyli tylko ~0.13% (około 650 komórek) jako przeżywające po 5 miesiącach (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wyraźnie środowisko siatkówki gospodarza narzuca silne presje selekcyjne, a przeżywalność pozostaje czynnikiem ograniczającym.

Drogi dostarczania: doszklistkowe a podsiatkówkowe

Wybór sposobu dostarczania RGC do oka ma praktyczne i biologiczne implikacje. Wstrzyknięcia doszklistkowe umieszczają komórki w żelu oka (ciele szklistym) obok siatkówki. Ta droga bezpośrednio nawilża wewnętrzną siatkówkę, ale może również narażać komórki na wyzwania dyfuzyjne (muszą przylgnąć do powierzchni siatkówki, aby się zintegrować). Jak wspomniano powyżej, zawiesiny komórek bez wsparcia mogą się zlepiać; przeżywalność może być słaba, chyba że komórki szybko migrują do tkanki gospodarza. Kilka badań wykazało, że przeszczepy oparte na rusztowaniach lub organoidach (zamiast zawiesin pojedynczych komórek) poprawiają wyniki (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Dostarczanie doszklistkowe ma tę zaletę, że technika jest stosunkowo prosta (jest już używana do iniekcji leków i wektorów terapii genowej) oraz pozwala na bezpośrednie celowanie w RGC.

Natomiast dostarczanie podsiatkówkowe (umieszczanie komórek między siatkówką a nabłonkiem barwnikowym siatkówki) jest tradycyjnie stosowane do przeszczepów fotoreceptorów lub RPE. W przypadku przeszczepów RGC jest to mniej intuicyjne, ale może zapewnić korzystny kontakt. W badaniu na kotach przeprowadzonym przez Singha i wsp., ludzkie organoidy siatkówki wszczepiono podsiatkówkowo w bliskim kontakcie z siatkówką gospodarza. Pomimo konieczności immunosupresji, przeszczepy te przeżyły przez tygodnie i wykazały oznaki tworzenia synaps z komórkami zwojowymi siatkówki (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wąska przestrzeń podsiatkówkowa utrzymywała komórki dawcy na miejscu. Jednak u kotów i naczelnych ta przestrzeń jest niezwykle cienka, co utrudnia celowanie. Chirurgia podsiatkówkowa wiąże się również z większym ryzykiem dla siatkówki gospodarza. Dlatego wstrzyknięcie doszklistkowe pozostaje standardowym podejściem u gryzoni, podczas gdy strategie podsiatkówkowe lub nasiatkówkowe (na powierzchnię siatkówki) mogą być badane w przypadku większych oczu.

Podsumowując, wstrzyknięcie doszklistkowe jest najłatwiejsze, ale często wymaga rusztowań lub dużej liczby komórek do jakiegokolwiek przeżycia (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Przeszczepy/klastery podsiatkówkowe mogą osiągnąć ścisły kontakt (jak w badaniu na kotach Singha (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)), ale stwarzają wyzwania chirurgiczne. Obie drogi są badane, i jest możliwe, że przyszłe protokoły będą łączyć osadzanie komórek w biokompatybilnych rusztowaniach lub żelach, aby zmaksymalizować połączenie dawca-gospodarz.

Bariery dla regeneracji aksonów i łączności

Nawet jeśli przeszczepione RGC przeżyją i zlokalizują się w oku, poważne przeszkody blokują ich zdolność do przekazywania wzroku do mózgu. W normalnym (dorosłym) ośrodkowym układzie nerwowym uszkodzone włókna nerwu wzrokowego nie regenerują się dobrze. Przeszczepione RGC napotykają to samo wrogie środowisko. Kluczowe bariery to:

Wzrost aksonów przez blaszkę sitową

Blaszka sitowa to struktura przypominająca sito w tarczy nerwu wzrokowego, przez którą aksony RGC opuszczają oko. Jest to główne wąskie gardło dla odrastania. W eksperymentach na zwierzętach naukowcy stwierdzają, że niewiele aksonów przeszczepionych RGC przekracza tę barierę. Jedno szczegółowe badanie donosiło, że „po wstrzyknięciu RGC do ciała szklistego, niewiele z nich zintegrowało się z siatkówką. Spośród RGC, które pomyślnie zintegrowały się z warstwą komórek zwojowych (GCL), wiele wytworzyło aksony, które rosły w kierunku tarczy nerwu wzrokowego, ale niewiele przekroczyło blaszkę sitową (~10%)” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Innymi słowy, 90% nowych aksonów zatrzymało się na blaszce. Blaszka zawiera gęstą tkankę glejową i macierz zewnątrzkomórkową, które prawdopodobnie wytwarzają sygnały hamujące i bariery fizyczne. Pokonanie tej przeszkody może wymagać albo modyfikacji aksonów dawcy (na przykład poprzez zwiększenie ekspresji szlaków promujących wzrost, takich jak mTOR lub Wnt), albo modyfikacji środowiska blaszki (na przykład przez zastosowanie enzymów lub neutralizację cząsteczek hamujących). Ten problem jest analogiczny do każdego urazu rdzenia kręgowego: właściwość OUN polegająca na niepowodzeniu regeneracji aksonów. Sugeruje to, że nawet jeśli umieścimy RGC w oku, wprowadzenie ich aksonów do nerwu wzrokowego będzie wymagało bardzo silnych bodźców promujących regenerację.

Kierowanie do celów mózgowych

Zakładając, że aksony RGC mogą opuścić oko, następnym wyzwaniem jest kierowanie aksonów na duże odległości do prawidłowych celów (głównie ciała kolankowatego bocznego (LGN) we wzgórzu i wzgórka górnego w śródmózgowiu). Podczas rozwoju aksony RGC są kierowane przez gradienty molekularne (np. białka efryna-A/EphA) i spontaniczną aktywność siatkówki. Mózgi dorosłych zazwyczaj nie posiadają tych sygnałów. Niektóre badania na gryzoniach wykazały, że możliwe jest skierowanie regenerujących aksonów RGC do ponownego połączenia ze wzgórkiem górnym: na przykład jeden model uszkodzenia szlaku wzrokowego zwiększył ekspresję genów promujących wzrost (mTOR, JAK/STAT) i zaobserwował nowe synapsy we wzgórku (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jednak te zregenerowane aksony nie przywróciły wzroku, chyba że były sztucznie wspierane (patrz mielinizacja poniżej). Krótko mówiąc, znalezienie właściwych sygnałów kierujących (lub ich dostarczenie) jest otwartym pytaniem badawczym. Przeszczepione aksony RGC idealnie odtwarzałyby embrionalne sygnały kierujące, tworząc prawidłową mapę retinotopową w mózgu, ale nadal nie jest jasne, jak to osiągnąć u dorosłych.

Tworzenie synaps

Nowe aksony muszą ostatecznie utworzyć synapsy z odpowiednimi neuronami docelowymi. Co cieszy, dowody sugerują, że przeszczepione RGC mogą tworzyć połączenia synaptyczne przynajmniej w obrębie siatkówki. W badaniu Johnsona i wsp., RGC pochodzące z hiPSC, które migrowały do GCL gospodarza, rozwinęły normalne drzewka dendrytyczne. Stosując barwienie markerami synaptycznymi i stymulację światłem, autorzy „wykazali tworzenie nowych i funkcjonalnych synaps między RGC dawcy a siatkówką gospodarza” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Innymi słowy, przeszczepione RGC były w stanie połączyć się z interneuronami dwubiegunowymi/amakrynowymi i przekazywać sygnały do dalszych komórek gospodarza, chociaż odpowiedzi były nieco słabsze niż w komórkach natywnych. To odkrycie wskazuje, że przynajmniej na poziomie wewnętrznej siatkówki, może dojść do odpowiedniego okablowania.

Tworzenie synaps w mózgu jest jeszcze trudniejsze do osiągnięcia i zmierzenia. Niektóre badania nad regeneracją (nie stricte badania przeszczepów) wywołały odrastanie aksonów RGC w kierunku wzgórka i tworzenie synaps (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). W wspomnianym modelu uszkodzenia szlaku wzrokowego, nowe aksony w regionie nadskrzyżowaniowym/wzgórkowym tworzyły synapsy, ale myszy nadal nie wykazywały mierzalnych zachowań wzrokowych. Później przypisano to brakowi mieliny (patrz następna sekcja), a nie wadliwym synapsom (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Podsumowując: synaptogeneza jest zasadniczo możliwa, ale zapewnienie solidnych, precyzyjnie ukierunkowanych synaps, które przywracają wzrok, jest dużym wyzwaniem. Prawdopodobnie będzie to wymagało sygnałów „podobnych do rozwojowych”, takich jak wzorcowana stymulacja światłem (fale siatkówkowe) lub współprzeszczepienie wspomagających komórek glejowych, aby kierować i wzmacniać nowe połączenia.

Mielinizacja zregenerowanych aksonów

Wreszcie, aksony RGC normalnie ulegają mielinizacji dopiero po przejściu przez blaszkę sitową – co jest interesującą cechą konstrukcyjną oka. Oligodendrocyty (komórki mielinizujące OUN) są utrzymywane poza siatkówką przez blaszkę (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Jeśli akson przeszczepionego RGC opuści oko, wchodzi do OUN, który posiada glej mielinizujący. Jednak w wielu przypadkach eksperymentalnych nowe aksony pozostają niemielinizowane. Jest to ważne, ponieważ niemielinizowane długie aksony OUN bardzo słabo przewodzą impulsy. W badaniu regeneracji szlaku wzrokowego (opisanym powyżej) autorzy odkryli, że nowo utworzone aksony były niemielinizowane, a myszy nie wykazywały poprawy wzroku, chyba że podano im 4-aminopirydynę (4-AP) – lek, który blokuje kanały potasowe i wzmacnia przewodzenie we włóknach zdemielinizowanych (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). W efekcie 4-AP częściowo przywróciła wzrok, kompensując brak mieliny. Wynik ten podkreśla: nawet jeśli akson RGC dotrze do celu, bez mieliny nie będzie przewodził sygnałów wystarczająco szybko, aby zapewnić widzenie. Zapewnienie prawidłowej mielinizacji – być może poprzez współprzeszczepienie prekursorów oligodendrocytów lub stymulację gleju gospodarza – będzie kluczowe.

Podsumowując, przeszczepione RGC stają w obliczu wielu wyzwań: tylko nieliczne przechodzą przez blaszkę sitową (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), muszą znaleźć właściwy korytarz do celów mózgowych, utworzyć odpowiednie synapsy, a następnie zostać otoczone mieliną. Każdy z tych kroków obecnie odnosi jedynie częściowy sukces w modelach zwierzęcych. Pokonanie tych barier jest aktywnym obszarem badań w neuroregeneracji.

Wyzwania immunologiczne i bezpieczeństwa

Oko jest stosunkowo uprzywilejowane immunologicznie, ale przeszczepianie komórek nadal wiąże się z ryzykiem ataku immunologicznego. Jeśli komórki dawcy są autologiczne (pochodzące z własnych iPSC pacjenta), odrzucenie jest minimalne, ale złożoność techniczna jest wysoka. Komórki allogeniczne (od innego dawcy lub z linii komórek macierzystych) są łatwiejsze do wyprodukowania, ale mogą zostać zaatakowane przez układ odpornościowy gospodarza. W badaniach na zwierzętach naukowcy często stosują leki immunosupresyjne w celu promowania przeżycia przeszczepu. Na przykład w badaniu przeszczepów organoidów u kotów, systemowa immunosupresja była wymagana, aby przeszczep przeżył i utworzył połączenia (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Bez immunosupresji komórki ksenogeniczne są szybko usuwane. Co ciekawe, większość badań przedklinicznych nad przeszczepami siatkówki donosi jedynie o niskim stopniu zapalenia, a nie o pełnym odrzuceniu – jest to korzyść wynikająca z barier oka (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jednak długoterminowy sukces prawdopodobnie będzie wymagał albo przejściowej immunosupresji, albo zaawansowanych technik (takich jak „maskowanie” komórek powłokami unikającymi układu odpornościowego) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wszelkie przyszłe badania na ludziach musiałyby się tym zająć, aby komórki RGC dawcy nie zostały zabite przez limfocyty T gospodarza.

Pewnym problemem jest również tumorogenność. Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą tworzyć potworniaki, jeśli przeszczepione zostaną niezróżnicowane komórki. Nawet niewielka liczba zanieczyszczających PSC w preparacie RGC mogłaby być katastrofalna. Dlatego naukowcy podkreślają wysoką czystość przeszczepianej populacji. Vrathasha i wsp. zauważają, że „krytyczne jest określenie czystości dawcy RGC w celu zmniejszenia ryzyka powstawania potworniaków” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Wymaga to gruntownej kontroli jakości – na przykład sortowania komórek za pomocą reporterów specyficznych dla RGC lub zastosowania cytometrii przepływowej, a także testowania metylacji genomu lub analizy ekspresji genów, aby upewnić się, że nie pozostały żadne komórki pluripotencjalne (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Do tej pory nie zgłoszono żadnych guzów w eksperymentach z przeszczepami RGC na małych zwierzętach, ale tłumaczenie kliniczne będzie wymagało niezwykle rygorystycznego oczyszczania i testowania uwalniania każdego produktu z komórek macierzystych.

Perspektywy: W kierunku badań na ludziach w jaskrze

Biorąc pod uwagę powyższe, poważne wyzwania, kiedy można realistycznie spodziewać się pierwszych badań klinicznych nad zastąpieniem RGC u pacjentów z jaskrą? Niestety, odpowiedź brzmi prawdopodobnie „nieprędko”. Dziedzina ta jest wciąż we wczesnych stadiach przedklinicznych (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Do tej pory nie zarejestrowano żadnych badań na ludziach specjalnie dla przeszczepu RGC w jaskrze. Istniejące „kliniki komórek macierzystych” (na przykład wprowadzające w błąd próby z autologicznymi komórkami tłuszczowymi lub szpiku kostnego) skupiały się na doraźnych podejściach i, co rażące, spowodowały szkody (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pacjenci powinni być ostrożni wobec nieudowodnionych terapii, które omijają nadzór FDA. Legalne pierwsze badania na ludziach wymagałyby solidnego potwierdzenia koncepcji na zwierzętach, dotyczącego każdej bariery, oraz rzetelnych danych dotyczących bezpieczeństwa. Może to potrwać wiele lat.

Pragmatyczna perspektywa zakłada, że małe badania bezpieczeństwa mogą rozpocząć się pod koniec lat 20. lub w latach 30. XXI wieku, jeśli postępy będą kontynuowane. Kandydatami byliby prawdopodobnie pacjenci z bardzo zaawansowaną chorobą (gdzie siatkówka i nerw wzrokowy mogą być w dużej mierze rozłączone) lub, odwrotnie, ci z chorobą w stadium pośrednim (aby zmaksymalizować szanse na jakąkolwiek korzyść). Początkowymi punktami końcowymi byłoby przede wszystkim bezpieczeństwo: brak niepożądanych reakcji zapalnych lub tworzenia się guzów w oku. Drugorzędne punkty końcowe miałyby na celu wykrycie wszelkich anatomicznych lub funkcjonalnych oznak „przyjęcia” przeszczepu. Na przykład obrazowanie siatkówki (optyczna koherencyjna tomografia) mogłoby wykazać pogrubienie warstwy włókien nerwowych siatkówki lub warstwy komórek zwojowych w miejscach wstrzyknięcia komórek. Testy elektrofizjologiczne, takie jak elektroretinogram wzorowany (PERG) lub wzrokowe potencjały wywołane (VEP), mogłyby ujawnić odpowiedzi elektryczne pochodzące z przeszczepionych komórek. Ostatecznie, funkcjonalne testy wzroku (takie jak pola widzenia lub czułość kontrastu) byłyby ważne, ale nawet wykazanie przywrócenia niewielkiego wycinka widzenia byłoby przełomowe. By analogii, ostatnie badania terapii genowej w dziedzicznych chorobach siatkówki mierzą wyniki w kategoriach strukturalnych vs. funkcjonalnych (pmc.ncbi.nlm.nih.gov); zastosowanie podobnych kategorii (anatomia OCT, elektrofizjologia, funkcja wzrokowa, wzrok zgłaszany przez pacjenta) byłoby odpowiednie.

Podsumowując, choć istnieje ostrożny optymizm, jakikolwiek praktyczny harmonogram jest długi. Każdy z powyższych kroków wymaga dopracowania. Realistyczne pierwsze badanie może zostać zaprojektowane w połowie lub pod koniec lat 30. XXI wieku, w zależności od przełomów w regeneracji aksonów i profilach bezpieczeństwa. Kandydaci i punkty końcowe byłyby wybierane ostrożnie: prawdopodobnie najpierw punkty końcowe dotyczące bezpieczeństwa, a następnie zastępcze wskaźniki integracji (obrazowanie, elektrofizjologia), zanim będzie można oczekiwać mierzalnych korzyści wzrokowych. Innymi słowy, dziedzina ta musi zrównoważyć nadzieję z realizmem – dążenie do zastąpienia RGC będzie maratonem badań, a nie krótkim sprintem.

Wnioski

Zastępowanie utraconych RGC w jaskrze ich laboratoryjnymi odpowiednikami to ekscytująca, lecz dopiero rodząca się idea. In vitro ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste można nakłonić do przekształcenia się w komórki przypominające RGC, ekspresjonujące kluczowe markery, a nawet niektóre cechy podtypów (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Badania przeszczepów na zwierzętach wykazały, że część tych komórek może przeżyć przez miesiące, zintegrować się z obwodem siatkówki i potencjalnie tworzyć synapsy (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jednak ogromne bariery pozostają. Wzrost aksonów poza blaszką sitową jest słaby (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), kierowanie do celów centralnych jest niewystarczająco kontrolowane, synapsy są słabe lub nieobecne, a aksony pozbawione mieliny (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Ponadto należy zarządzać odrzuceniem immunologicznym i ryzykiem guzów. Na razie naukowcy nadal zajmują się każdym wyzwaniem po kolei. Dopóki nie będziemy w stanie niezawodnie hodować, dostarczać i łączyć RGC pochodzących z komórek macierzystych, przeszczepy przywracające wzrok pozostaną w laboratorium. Ale stały postęp daje nadzieję: dzięki ciągłym innowacjom i ostrożności, marzenie o zastąpieniu RGC „od szalki Petriego do szlaku wzrokowego” może pewnego dnia przenieść się z eksperymentu do leczenia.