Johdanto

Glaukooma on johtava peruuttamattoman sokeuden syy maailmanlaajuisesti, koska silmän aivoihin yhdistävät verkkokalvon ganglion solut (RGC-solut) kuolevat eivätkä uusiudu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ilman RGC-soluja verkkokalvolta tulevat näkösignaalit eivät pääse aivokeskuksiin (kuten sivummaiselle polvitumakkeelle ja ylänäkökukkulalle), joten näkö katoaa. Nykyiset glaukooman hoidot (esim. silmänpaineen alentaminen) voivat suojella eloon jääneitä RGC-soluja, mutta ne eivät voi palauttaa jo menetettyjä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kantasoluhoidolla pyritään korvaamaan menetetyt RGC-solut eriyttämällä ihmisen pluripotentteja kantasoluja (joko alkion kantasoluja, ESC-soluja, tai indusoituja pluripotentteja kantasoluja, iPSC-soluja) RGC-soluiksi ja siirtämällä ne silmään (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Periaatteessa tämä voisi tarjota rajattoman verkkokalvon hermosolujen lähteen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Mutta tämän vision toteuttaminen edellyttää valtavien haasteiden ylittämistä: uusien RGC-solujen on selviydyttävä, kasvatettava aksoneita silmän uloskäynnin (lamina cribrosa) läpi näköhermoon, navigoitava pitkiä matkoja tarkkoihin aivokohteisiin, muodostettava toimivia synapseja ja myelinisoitava – kaikki aikuisen keskushermoston estävässä ympäristössä.

Tässä artikkelissa tarkastellaan ihmisen kantasoluista peräisin olevien RGC-solujen eriyttämisen ja niiden eläinmalleihin siirtämisen nykytilaa. Käsittelemme sitten kriittisiä esteitä menestykselle – aksonien laajentuminen lamina cribrosan läpi, ohjaus talamuksen ja kukkulan kohteisiin, synapsien muodostuminen ja myelinaatio – sekä turvallisuuskysymyksiä (immuunivasteen hylkiminen, kasvaimen riski) ja annostelumenetelmiä (lasiaiseen annostelu vs. verkkokalvon alle injektointi). Lopuksi esitämme realistisen arvion siitä, milloin ”ensimmäiset ihmiskokeet” glaukooman hoidossa voisivat olla toteutettavissa ja mitä tulosmittareita ne edellyttäisivät. Pyrimme kauttaaltaan selkeyteen: avaintermimme on lihavoitu, ja kaikki tekniset käsitteet selitetään maallikoille ymmärrettävästi.

RGC-solujen eriyttäminen ihmisen pluripotentteista kantasoluista

Tieteilijät ovat kehittäneet monia protokollia ihmisen ESC- tai iPSC-solujen muuttamiseksi RGC-solujen kaltaisiksi hermosoluiksi. Tyypillisesti kantasolut ohjataan ensin verkkokalvon progenitorisolujen tilaan käyttämällä yhdistelmiä kasvutekijöitä ja pienimolekyylisiä aineita, jotka jäljittelevät silmän kehitystä (esimerkiksi FGF, IGF, BMP, Wnt- ja Notch-reitin modulaattorit) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Oikeissa olosuhteissa nämä solut eriytyvät edelleen RGC-soluiksi, mikä voidaan vahvistaa RGC-merkkiaineilla. Keskeisiä merkkiaineita ovat transkriptiotekijät BRN3B (POU4F2) ja ISL1, RNA:ta sitova proteiini RBPMS, hermosolujen sytoskeleton proteiini β-III tubuliini (TUJ1) ja synukleiini-γ (SNCG). Eräs tutkimus osoitti, että PSC-peräiset viljelmät ilmensivät useita RGC-merkkiaineita: ”transkriptiotekijät, kuten BRN3, ISL1 ja SNCG” ilmestyivät pitkien neurittien rinnalla, mikä vahvisti RGC-identiteetin (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nämä kantasoluperäiset RGC-solut muistuttavat luonnollisia vastineitaan geeniekspressioltaan ja morfologialtaan, ulottaen pitkiä haaroja ja laukaisten aktiopotentiaaleja.

RGC-solut eivät ole yhtenäinen solutyyppi. RGC-soluja on olemassa kymmeniä alatyyppejä (esim. liikkeelle herkät suuntaherkät solut, on/off-keskussolut, luonnostaan valoherkät melanopsiinisolut, alfa-RGC-solut jne.), joilla kullakin on omat toiminnot (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eläintutkimukset ovat luetteloineet yli 30 RGC-alatyppiä anatomian ja molekyylimerkkien perusteella (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ja todisteet viittaavat siihen, että ihmisillä on noin 20 tai enemmän alatyyppiä, joilla on ainutlaatuiset yhteydet (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Teoriassa kantasoluprotokollia voitaisiin virittää tuottamaan tiettyjä alatyyppejä säätämällä kehityksellisiä vihjeitä. Käytännössä useimmat nykyiset menetelmät pyrkivät tuottamaan sekoitetun RGC-solukannan. Tutkijat varmistavat sitten alatyyppien monimuotoisuuden kaksoisvärjäyksellä merkkiaineyhdistelmien osalta: esimerkiksi yksi ihmisen RGC-eriyttämistutkimus tunnisti ehdokkaita on–off-suuntaherkkiä RGC-soluja (jotka ilmentävät CARTia) ja alfa-RGC-soluja (jotka ilmentävät SPP1/osteopontiinia) BRN3+-soluistaan (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Alatyypin spesifikaation optimointi on aktiivinen tutkimusalue, sillä jokainen RGC-alatyyppi (omine pre- ja post-synaptisine kumppaneineen) tarvitsee asianmukaisen integraation in vivo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

RGC-solujen tuotannon tehokkuus ja nopeus ovat parantuneet. Varhaiset protokollat veivät useita viikkoja tai kuukausia, mutta uudemmat menetelmät nopeuttavat prosessia. Esimerkiksi Luo et al. muunsivat transkriptiotekijä NGN2:n yliekspression ja neurotroofisen kasvualustan avulla tuottamaan RGC-solujen kaltaisia hermosoluja vain kahdessa viikossa, verrattuna 1–2 kuukauteen aiemmissa 2D- tai 3D-viljelmissä (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nämä solut ilmensivät RGC-merkkiaineita ja, kun ne siirrettiin aikuisen rotan silmiin, ”migroituivat menestyksekkäästi ganglionisolukerrokseen 1 viikossa” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Vastaavasti pluripotentit kantasolut, jotka kasvatetaan 3D-verkkokalvon organoideina (jotka jäljittelevät silmän kehitystä), tuottavat luonnostaan RGC-soluja muiden verkkokalvon hermosolujen ohella. Organoidiperäisten RGC-solujen geeniekspressioprofiilit ovat yleensä lähempänä sikiön RGC-soluja kuin 2D-viljelmien, ja monet ryhmät keräävät nyt RGC-rikastettuja soluja organoideista siirtoja varten (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Edistyksestä huolimatta saannot pysyvät vaatimattomina ja viljelmät ovat heterogeenisiä. Protokollat tuottavat usein sekamuotoisen verkkokalvon solukannan, jossa on vähemmistö RGC-soluja, ja solujen eloonjääminen viljelmässä voi olla rajallista (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tutkijat käyttävät tyypillisesti solujen lajittelua (esim. Thy1 tai BRN3 raportterit) RGC-solujen puhdistamiseksi ennen siirtoa. Suuri tavoite on saavuttaa erittäin korkea puhtaus, koska kaikki erilaistumattomat tai väärään kohteeseen menevät solut voivat muodostaa kasvaimia. Tuore tutkimus varoitti, että ”translationaalisissa tutkimuksissa on kriittistä määrittää luovuttajan RGC-solujen puhtaus teratooman muodostumisen riskin vähentämiseksi” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Siirto eläinmalleissa: Eloonjääminen ja integraatio

Useissa prekliinisissä tutkimuksissa on nyt testattu ihmisen kantasoluista johdettuja RGC-soluja eläinmalleissa. Tavoitteena on osoittaa, että siirretyt RGC-solut voivat selviytyä, integroitua isännän verkkokalvoon, kasvattaa aksoneita ja (lopulta) välittää signaaleja. Kokeita on tehty enimmäkseen jyrsijöillä (hiirillä, rotilla), mutta myös suuremmilla eläimillä (kissoilla) ja ei-ihmisprimateilla.

Eriyttämisen tai RGC-solujen eristämisen jälkeen in vitro tutkijat annostelevat ne isännän silmään. Kaksi päästrategiaa ovat lasiaiseen annostelu (solujen injektointi lasiaiseen, silmän sisempään onteloon) tai verkkokalvon alle annostelu (solujen sijoittaminen verkkokalvon alle). Tulokset vaihtelevat:

- Lasiaiseen injektointi on teknisesti suoraviivaista RGC-solujen kohdistamiseen (jotka sijaitsevat verkkokalvon sisäpinnalla). Useat ryhmät ovat injektoineet ihmisen RGC-solujen tai verkkokalvon organoideista peräisin olevien RGC-solujen suspensiota jyrsijöiden lasiaiseen. Esimerkiksi Vrathasha et al. injektoivat noin 50 000 ihmisen iPSC-RGC-solua lasiaiseen WS-hiiriin ja havaitsivat, että siirretyt solut paikantuivat ganglionisolukerrokseen ja selvisivät vähintään viisi kuukautta siirron jälkeen (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nämä solut muodostivat normaaleja dendriittihaaroja ja synnyttivät valoärsykkeen laukaisemia aktiopotentiaaleja, jotka olivat lähes identtisiä alkuperäisten hiiren RGC-solujen kanssa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), todistaen, että ne pystyivät integroitumaan toiminnallisesti ainakin verkkokalvoon. Luo et al. (2020) osoittivat vastaavasti, että hESC-peräiset RGC-solujen kaltaiset solut (NGN2:ta yliekspressoivat) migroituivat aikuisten rottien ganglionikerrokseen viikon kuluessa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nämä tulokset ovat rohkaisevia, mutta todella integroituvien solujen määrä on yleensä pieni. Vrathasha raportoi keskimäärin noin 672 selviytynyttä luovuttajasolua hiiren verkkokalvoa kohti (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) – tämä on pieni osa normaaleista RGC-solumääristä – mikä korostaa haastavaa ympäristöä.

Yksi ongelma yksinkertaisissa lasiaiseen annosteltavissa suspensioissa on se, että solut usein kasautuvat tai eivät tartu kiinni. Kissan RGC-vauriomallissa Becker et al. havaitsivat, että lasiaiseen tehty solususpension injektio johti solujen kasaantumiseen ja vähäiseen todelliseen integraatioon (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). He totesivat, että telineen käyttö voisi parantaa eloonjäämistä ja verkkokalvon migraatiota. Jotkut tutkimukset upottavatkin RGC-soluja biomateriaalitelineisiin tai organoidikudokseen niiden tukemiseksi. Esimerkiksi ihmisen verkkokalvon organoideja (RGC-soluja kerättiin kehityspäivinä 60–70) siirrettiin verkkokalvon alle kissan silmiin. Systeemisen immunosuppression avulla nämä organoidisiirteet selvisivät vähintään kuukauden ajan ja näyttivät muodostavan synaptisia kontakteja isännän hermosolujen kanssa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Verkkokalvon alle annostelu varmisti tiukan kontaktin luovuttajakudoksen ja verkkokalvon välillä, kun taas lasiaiseen annostellut solususpensiot yleensä kelluivat tai kasaantuivat. Toisaalta verkkokalvon alle annostelu on monimutkaisempi leikkaus ja sitä saattaa rajoittaa käytettävissä oleva tila (verkkokalvon alainen tila on ohut nelijalkaisilla ja primateilla).

Pienillä jyrsijöillä lasiaiseen annostelu on edelleen yleisin lähestymistapa. Injektion jälkeen on havaittu menestyksekkäiden luovuttajasolujen migroituvan isännän verkkokalvon ganglionisolukerrokseen ja ilmentävän RGC-merkkiaineita (BRN3, RBPMS) viikkoja tai kuukausia (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Jotkut tutkimukset raportoivat luovuttajasolujen kasvattavan uusia dendriittejä ja jopa alkavia aksonihaaroja kohti näköhermon nystyä. Esimerkiksi hiiriin siirretyt hiPSC-RGC-solut osoittivat kehittyneitä dendriittipuita ja (valolla stimuloituina) tuottivat postsynaptisia potentiaaleja, mikä viittaa siihen, että ne olivat muodostaneet synapseja bipolaaristen/amakriinisten interneuronien kanssa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). On kuitenkin tärkeää olla varovainen: kokemukset fotoreseptorisiirroista osoittavat, että siirretyt fluoresoivat merkkiaineet voivat joskus antaa vaikutelman, että siirretyt solut ovat integroituneet, vaikka ne ovat itse asiassa vain siirtäneet väriainetta isännän soluihin (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Todellisen integraation vahvistamiseksi tarvitaan tarkkaa merkintää ja toiminnallista testausta. Toistaiseksi kaikissa tapauksissa vain osa injektoiduista RGC-soluista selviytyy ja integroituu. Esimerkiksi Vrathasha et al. injektoivat 500 000 solua, mutta laskivat myöhemmin vain noin 0,13 % (noin 650 solua) selvinneen 5 kuukauden kuluttua (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). On selvää, että isännän verkkokalvon ympäristö asettaa voimakkaita valintapaineita, ja eloonjääminen on edelleen rajoittava tekijä.

Annostelureitit: Lasiaiseen vs. verkkokalvon alle

Valinnalla, miten RGC-solut toimitetaan silmään, on käytännöllisiä ja biologisia vaikutuksia. Lasiaiseen injektoinnit sijoittavat solut silmän geeliin (lasiaiseen) verkkokalvon viereen. Tämä reitti huuhtelee suoraan sisempää verkkokalvoa, mutta voi myös altistaa soluja diffuusion haasteille (niiden on tartuttava verkkokalvon pintaan integroitumiseksi). Kuten edellä mainittiin, tukemattomat solususpensiot voivat kasaantua; eloonjääminen voi olla heikkoa, elleivät solut nopeasti migroidu isäntäkudokseen. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että telineelliset tai organoidipohjaiset siirteet (yksisolususpensioiden sijaan) parantavat tuloksia (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Lasiaiseen annostelussa on etuna suhteellisen yksinkertainen tekniikka (sitä käytetään jo lääkeinjektioissa ja geeniterapiavektoreissa) sekä suora RGC-solujen kohdistaminen.

Sen sijaan verkkokalvon alle annostelu (solujen sijoittaminen verkkokalvon ja verkkokalvon pigmenttiepiteelin väliin) on perinteisesti käytetty fotoreseptori- tai RPE-solujen siirroissa. RGC-solusiirroissa se on vähemmän intuitiivinen, mutta voi tarjota edullisen kontaktin. Singhin et al. kissatutkimuksessa ihmisen verkkokalvon organoideja implantoitiin verkkokalvon alle tiiviisti isännän verkkokalvoon kiinnittyneinä. Immuunisuppression tarpeesta huolimatta nämä siirteet selvisivät viikkoja ja osoittivat merkkejä synapsien muodostumisesta verkkokalvon ganglionisolujen kanssa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kapea verkkokalvon alainen tila piti luovuttajasolut paikallaan. Kuitenkin kissoilla ja primateilla tämä tila on erittäin ohut, mikä tekee kohdistamisesta haastavaa. Verkkokalvon alainen leikkaus sisältää myös suuremman riskin isännän verkkokalvolle. Siksi lasiaiseen injektointi pysyy standardimenetelmänä jyrsijöillä, kun taas verkkokalvon alaisia tai epiretinaalisia (verkkokalvon pinnalle) strategioita voidaan tutkia suuremmissa silmissä.

Yhteenvetona, lasiaiseen injektointi on helpointa, mutta vaatii usein telineitä tai suuria solumääriä eloonjäämiseksi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Verkkokalvon alaiset siirteet/soluryppäät voivat saavuttaa tiukan kontaktin (kuten Singhin kissatutkimuksessa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)), mutta ne aiheuttavat kirurgisia haasteita. Molemmat reitit ovat tutkittavina, ja on mahdollista, että tulevissa protokollissa yhdistetään solujen upottaminen biologisesti yhteensopiviin telineisiin tai geeleihin luovuttajan ja isännän välisen yhteyden maksimoimiseksi.

Esteet aksonien uudistumiselle ja yhteyksille

Vaikka siirretyt RGC-solut selviytyisivät ja asettuisivat paikoilleen silmässä, merkittävät esteet estävät niiden kyvyn välittää näköä aivoihin. Normaalissa (aikuisen) keskushermostossa vaurioituneet näköhermokuidut eivät kasva hyvin takaisin. Siirretyt RGC-solut kohtaavat saman vihamielisen ympäristön. Keskeisiä esteitä ovat:

Aksonien kasvu lamina cribrosan läpi

Lamina cribrosa on siivilän kaltainen rakenne näköhermon nystyessä, josta RGC-aksonit poistuvat silmästä. Se on merkittävä pullonkaula uudelleenkasvulle. Eläinkokeissa tutkijat havaitsevat, että harvat siirretyt RGC-aksonit ylittävät tämän esteen. Eräs tarkka tutkimus raportoi, että ”kun RGC-soluja injektoitiin lasiaiseen, vain harvat integroituivat verkkokalvoon. Niistä RGC-soluista, jotka onnistuneesti integroituivat GCL:ään, monet kasvattivat aksoneita, jotka suuntautuivat näköhermon nystyyn, mutta harvat kasvoivat lamina cribrosan ohi (~10%)” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Toisin sanoen 90 % uusista aksoneista pysähtyi laminaan. Lamina sisältää tiheää gliaa ja solunulkoista matriisia, jotka todennäköisesti tuottavat estäviä signaaleja ja fyysisiä esteitä. Tämän esteen ylittämiseksi saatetaan tarvita joko luovuttajaksonien muokkaamista (esim. säätelemällä ylöspäin kasvua edistäviä reittejä, kuten mTOR tai Wnt) tai laminan ympäristön muokkaamista (esim. entsyymien levittäminen tai estävien molekyylien neutraloiminen). Tämä ongelma on analoginen minkä tahansa selkäydinvamman kanssa: keskushermoston aksonien uudelleenkasvun epäonnistumisen ominaisuus. Se viittaa siihen, että vaikka asettaisimme RGC-soluja silmään, niiden aksonien saaminen näköhermoon vaatii erittäin voimakkaita uudistumista edistäviä ärsykkeitä.

Ohjaus aivokohteisiin

Olettaen, että RGC-aksonit voivat poistua silmästä, seuraava haaste on aksonien ohjaus pitkien matkojen yli oikeisiin kohteisiin (ensisijaisesti talamuksen sivummainen polvitumake (LGN) ja keskiaivojen ylänäkökukkula). Kehityksen aikana RGC-aksoneita ohjaavat molekyyligradientit (esim. efriini-A/EphA-proteiinit) ja spontaani verkkokalvon aktiivisuus. Aikuisten aivoilta nämä vihjeet yleensä puuttuvat. Jotkut jyrsijätutkimukset ovat osoittaneet, että uudelleenkasvavia RGC-aksoneita on mahdollista ohjata yhdistymään ylänäkökukkulaan: esimerkiksi yksi näköhermoradan leesion malli sääti ylöspäin kasvua edistäviä geenejä (mTOR, JAK/STAT) ja havaitsi uusia synapseja kukkulassa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Nämä uudelleenkasvaneet aksonit eivät kuitenkaan palauttaneet näköä, elleivät ne saaneet keinotekoista tukea (katso myelinaatio alla). Lyhyesti sanottuna oikeiden ohjaussignaalien löytäminen (tai niiden tarjoaminen) on avoin tutkimuskysymys. Siirrettyjen RGC-aksonien tulisi ihanteellisesti toistaa alkionkehityksen ohjausvihjeitä muodostaakseen oikean retinotopisen kartan aivoissa, mutta on edelleen epäselvää, miten tämä saavutetaan aikuisilla.

Synapsien muodostuminen

Uusien aksonien on lopulta muodostettava synapseja oikeiden kohdehermosolujen kanssa. Rohkaisevasti todisteet viittaavat siihen, että siirretyt RGC-solut voivat muodostaa synaptisia yhteyksiä ainakin verkkokalvon sisällä. Johnson et al. tutkimuksessa isännän GCL:ään migroituneet hiPSC-peräiset RGC-solut kehittivät normaalit dendriittipuut. Synapsimerkkiainevärjäyksen ja valoärsytyksen avulla kirjoittajat ”osoittivat uusien ja toimivien synapsien muodostumisen luovuttaja-RGC-solujen ja isännän verkkokalvon välillä” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Toisin sanoen siirretyt RGC-solut pystyivät muodostamaan yhteyksiä bipolaaristen/amakriinisten interneuronien kanssa ja välittämään signaaleja alavirran isäntäsoluihin, vaikkakin vasteet olivat jonkin verran heikompia kuin alkuperäisillä soluilla. Tämä löydös osoittaa, että ainakin sisemmän verkkokalvon tasolla voi tapahtua asianmukainen kytkentä.

Synapsien muodostuminen aivoissa on vieläkin vaikeampi saavuttaa ja mitata. Jotkut uudistumistutkimukset (eivät siirtotutkimukset sinänsä) ovat indusoineet RGC-aksoneita kasvamaan takaisin kohti kukkulaa ja muodostamaan synapseja (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Edellä mainitussa näköhermoradan leesion mallissa uusista aksoneista suprachiasmaattisella/kukkula-alueella muodostui synapseja, mutta hiirillä ei silti ollut mitattavaa näkökäyttäytymistä. Tämä johtui myöhemmin myeliinin puutteesta (katso seuraava osio) pikemminkin kuin virheellisistä synapseista (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Yhteenveto: Synaptogeneesi on periaatteessa mahdollista, mutta vankkojen, tarkasti kohdennettujen synapsien varmistaminen, jotka palauttavat näön, on suuri este. Se vaatii todennäköisesti ”kehityksen kaltaisia” vihjeitä, kuten kuvioitua valoärsytystä (verkkokalvon aallot) tai tukisolujen gliasolujen yhteissiirtoa, uusien yhteyksien ohjaamiseksi ja vahvistamiseksi.

Uudelleenkasvaneiden aksonien myelinaatio

Lopuksi, RGC-aksonit myelinisoituvat yleensä vasta sen jälkeen, kun ne ovat kulkeneet lamina cribrosan läpi – mielenkiintoinen silmän rakenteellinen piirre. Oligodendrosyytit (keskushermoston myelinisoivat solut) pidetään poissa verkkokalvosta laminan avulla (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Jos siirretyn RGC-solun aksoni poistuu silmästä, se päätyy keskushermostoon, jossa on myelinisoivia gliasoluja. Kuitenkin monissa kokeellisissa tapauksissa uudet aksonit jäävät myelinisoitumattomiksi. Tämä on tärkeää, koska myelinisoitumattomat pitkät keskushermoston aksonit johtavat impulsseja erittäin huonosti. Edellä kuvatussa näköhermoradan uudistumistutkimuksessa kirjoittajat havaitsivat, että vastamuodostuneet aksonit olivat myelinisoitumattomia, ja hiirillä ei ollut havaittavissa näön paranemista, ellei niille annettu 4-aminopyridiiniä (4-AP) – lääkettä, joka estää kaliumkanavia ja tehostaa johtumista demyelinisoiduissa kuiduissa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Käytännössä 4-AP palautti näön osittain kompensoimalla myeliinin puutetta. Tämä tulos korostaa pointtia: vaikka RGC-aksoni saavuttaisikin kohteensa, ilman myeliiniä se ei johda signaaleja riittävän nopeasti näköä varten. Oikean myelinaation varmistaminen – ehkä siirtämällä oligodendrosyyttien esiastesoluja tai stimuloimalla isännän gliasoluja – on ratkaisevan tärkeää.

Yhteenvetona, siirretyt RGC-solut kohtaavat haasteita: vain harvat kasvavat lamina cribrosan ohi (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), niiden on löydettävä oikea käytävä aivokohteisiin, muodostettava asianmukaiset synapsit ja sitten ne on ympäröitävä myeliinillä. Jokaisessa vaiheessa on toistaiseksi vain osittaista menestystä eläinmalleissa. Näiden esteiden ylittäminen on aktiivinen tutkimusalue neuro-regenerationissa.

Immuuni- ja turvallisuushaasteet

Silmä on suhteellisen immuuniprivilegioitu, mutta solujen siirto sisältää silti immuunihyökkäyksen riskin. Jos luovuttajasolut ovat autologisia (potilaan omista iPSC-soluista), hylkiminen on minimaalista, mutta tekninen monimutkaisuus on korkea. Allogeeniset solut (toisen luovuttajan tai kantasolulinjan) ovat helpompia tuottaa, mutta isännän immuunijärjestelmä saattaa hyökätä niitä vastaan. Eläintutkimuksissa tutkijat käyttävät usein immunosuppressiivisia lääkkeitä siirteen selviytymisen edistämiseksi. Esimerkiksi kissan organoidisiirtotutkimuksessa systeeminen immunosuppressio oli välttämätöntä siirteen selviytymiselle ja yhteyksien muodostumiselle (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ilman immunosuppressiota ksenogeeniset solut poistetaan nopeasti. Mielenkiintoista on, että useimmat verkkokalvosiirtojen prekliiniset tutkimukset raportoivat vain matala-asteista tulehdusta täyden hylkimisen sijaan – mikä on silmän esteiden etu (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Pitkäaikainen menestys vaatii kuitenkin todennäköisesti joko tilapäistä immunosuppressiota tai edistyksellisiä tekniikoita (kuten solujen ”naamioimista” immuunijärjestelmää välttelevillä pinnoitteilla) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kaikissa tulevissa ihmiskokeissa olisi käsiteltävä tätä, jotta isännän T-solut eivät tuhoa luovuttajan RGC-soluja.

Aiheeseen liittyvä huolenaihe on kasvainten muodostuminen. Pluripotentit kantasolut voivat muodostaa teratoomia, jos erilaistumattomia soluja siirretään. Jopa pieni määrä PSC-epäpuhtauksia RGC-valmisteessa voisi olla kohtalokasta. Siksi tutkijat korostavat siirretyn populaation korkeaa puhtautta. Vrathasha et al. toteavat, että on ”kriittistä määrittää luovuttaja-RGC-solujen puhtaus teratooman muodostumisen riskin vähentämiseksi” (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Tämä vaatii perusteellista laadunvalvontaa – esimerkiksi solujen lajittelua RGC-spesifisten raportterien avulla tai virtaussytometriaa, sekä testausta genomin metylaatio- tai geeniekspressioanalyysien avulla varmistaakseen, ettei pluripotentteja soluja jää jäljelle (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Toistaiseksi pieneläinten RGC-siirtokokeissa ei ole raportoitu kasvaimia, mutta kliininen käyttö edellyttää erittäin tiukkaa puhdistusta ja kaikkien kantasolutuotteiden vapautustestausta.

Tulevaisuudennäkymät: Kohti ihmiskokeita glaukooman hoidossa

Edellä mainitut valtavat haasteet huomioiden, milloin voitaisiin kohtuudella odottaa ensimmäistä kliinistä koetta RGC-solujen korvaamiseksi glaukoomapotilailla? Valitettavasti vastaus on todennäköisesti ”ei vielä pitkään aikaan”. Ala on edelleen varhaisessa prekliinisessä vaiheessa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Toistaiseksi yksikään ihmiskoe ei ole rekisteröity erityisesti RGC-solujen siirtoon glaukooman hoidossa. Nykyiset ”kantasoluklinikat” (esimerkiksi harhaanjohtavat kokeet autologisilla rasva- tai luuytinsoluilla) ovat keskittyneet ad hoc -lähestymistapoihin ja, räikeästi, aiheuttaneet haittaa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Potilaiden tulisi varoa todistamattomia hoitoja, jotka kiertävät FDA:n valvontaa. Legitiimit ensimmäiset ihmiskokeet vaatisivat vankan konseptitodisteen eläimillä, jotka käsittelevät kutakin estettä, sekä vankat turvallisuustiedot. Tämä voi viedä useita vuosia.

Pragmaattinen näkemys on, että pienet turvallisuustutkimukset voisivat alkaa 2020-luvun lopulla tai 2030-luvulla, jos kehitys jatkuu. Ehdokkaana olisivat todennäköisesti potilaat, joilla on erittäin pitkälle edennyt sairaus (jossa verkkokalvo ja näköhermo voivat olla suurelta osin irtautuneet), tai päinvastoin ne, joilla on keskivaiheen sairaus (mahdollisen hyödyn maksimoimiseksi). Ensisijaiset päätetapahtumat olisivat aluksi turvallisuus: haitallisten tulehdusreaktioiden tai kasvainten muodostumisen puuttuminen silmässä. Toissijaisten päätetapahtumien tavoitteena olisi havaita kaikki siirteen ”kiinnittymisen” anatomiset tai toiminnalliset merkit. Esimerkiksi verkkokalvon kuvantamisella (optinen koherenssitomografia) voitaisiin etsiä verkkokalvon hermosäiekerroksen tai ganglionisolukerrosen paksuuntumista alueella, johon solut injektoitiin. Elektrofysiologiset testit, kuten kuvioelektroretinogrammi (PERG) tai visuaalisesti herätetyt potentiaalit (VEP), saattaisivat paljastaa siirretyistä soluista peräisin olevia sähköisiä vasteita. Lopulta toiminnalliset näkötestit (kuten näkökentät tai kontrastien herkkyys) olisivat tärkeitä, mutta jopa pienen näkökentän kaaren palautumisen osoittaminen olisi uraauurtavaa. Analogisesti, viimeaikaiset geeniterapiakokeet perinnöllisten verkkokalvosairauksien hoidossa mittaavat tuloksia rakenteellisissa vs. toiminnallisissa kategorioissa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov); vastaavat kategoriat (OCT-anatomia, elektrofysiologia, näkötoiminto, potilaan ilmoittama näkö) pätevät.

Yhteenvetona, vaikka varovainen optimismi on paikallaan, kaikki käytännön aikataulut ovat pitkiä. Jokainen edellä mainituista vaiheista vaatii hienosäätöä. Realistinen ensimmäinen koe voitaisiin suunnitella 2030-luvun puolivälissä tai loppupuolella, riippuen aksonien uudelleenkasvun ja turvallisuusprofiilien läpimurroista. Ehdokkaat ja päätetapahtumat valittaisiin huolellisesti: luultavasti ensisijaisesti turvallisuuteen liittyvät päätetapahtumat, sitten integraation surrogaatit (kuvantaminen, elektrofysiologia) ennen mitattavien näköparannusten odottamista. Toisin sanoen alan on tasapainotettava toivo ja realismi – RGC-solujen korvaamisen tavoittelu tulee olemaan tutkimuksen maraton pikemminkin kuin nopea sprintti.

Johtopäätös

Menetettyjen RGC-solujen korvaaminen glaukoomassa laboratoriossa kasvatetuilla vastineilla on jännittävä mutta vasta syntymässä oleva idea. In vitro, ihmisen pluripotentteja kantasoluja voidaan ohjata RGC-solujen kaltaisiksi soluiksi, jotka ilmentävät keskeisiä merkkiaineita ja jopa joitakin alatyyppien ominaisuuksia (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Eläimillä tehdyt siirtotutkimukset ovat osoittaneet, että osa näistä soluista voi selviytyä kuukausia, integroitua verkkokalvon hermoverkkoon ja mahdollisesti muodostaa synapseja (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Kuitenkin valtavia esteitä on jäljellä. Aksonien kasvu lamina cribrosan ohi on heikkoa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), ohjaus keskeisiin kohteisiin on riittämättömästi hallittua, synapsit ovat heikkoja tai puuttuvat, ja aksoneista puuttuu myeliini (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Lisäksi immuunivasteen hylkimistä ja kasvaimien riskejä on hallittava. Toistaiseksi tutkijat jatkavat kunkin haasteen käsittelyä vuorollaan. Ennen kuin pystymme luotettavasti kasvattamaan, toimittamaan ja yhdistämään kantasoluperäisiä RGC-soluja, näköä palauttavat siirteet pysyvät laboratoriossa. Mutta tasainen edistyminen antaa toivoa: jatkuvalla innovaatiolla ja varovaisuudella unelma ”petimaljalta näköhermorataan” ulottuvasta RGC-solujen korvaamisesta voi jonain päivänä siirtyä kokeilusta parannukseksi.