Εισαγωγή

Το γλαύκωμα είναι η κύρια αιτία μη αναστρέψιμης τύφλωσης παγκοσμίως, επειδή τα αμφιβληστροειδικά γαγγλιακά κύτταρα (RGCs) που συνδέουν το μάτι με τον εγκέφαλο πεθαίνουν και δεν μπορούν να αναγεννηθούν (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Χωρίς RGCs, τα οπτικά σήματα από τον αμφιβληστροειδή δεν μπορούν να φτάσουν στα κέντρα του εγκεφάλου (όπως ο πλάγιος γονατώδης πυρήνας και το άνω κολπίο), οπότε χάνεται η όραση. Οι τρέχουσες θεραπείες για το γλαύκωμα (π.χ. μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης) μπορούν να προστατεύσουν τα επιζώντα RGCs, αλλά δεν μπορούν να αποκαταστήσουν αυτά που έχουν ήδη χαθεί (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Η θεραπεία με βλαστοκύτταρα στοχεύει στην αντικατάσταση των χαμένων RGCs διαφοροποιώντας ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (είτε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, ESCs, είτε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα, iPSCs) σε RGCs και μεταμοσχεύοντάς τα στο μάτι (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Κατ' αρχήν, αυτό θα μπορούσε να προσφέρει μια απεριόριστη πηγή αμφιβληστροειδικών νευρώνων (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ωστόσο, η υλοποίηση αυτού του οράματος απαιτεί την υπέρβαση τεράστιων προκλήσεων: τα νέα RGCs πρέπει να επιβιώσουν, να αναπτύξουν άξονες μέσω της εξόδου του ματιού (της lamina cribrosa) μέσα στο οπτικό νεύρο, να διανύσουν μεγάλες αποστάσεις προς ακριβείς εγκεφαλικούς στόχους, να σχηματίσουν λειτουργικές συνάψεις και να μυελινωθούν – όλα αυτά στο ανασταλτικό περιβάλλον του κεντρικού νευρικού συστήματος των ενηλίκων.

Αυτό το άρθρο ανασκοπεί την τρέχουσα κατάσταση της τέχνης στην παραγωγή RGCs από ανθρώπινα βλαστοκύτταρα και τη μεταμόσχευσή τους σε ζωικά μοντέλα. Στη συνέχεια, συζητάμε κρίσιμα εμπόδια στην επιτυχία – την επέκταση του άξονα μέσω της lamina cribrosa, την καθοδήγηση προς θαλαμικούς και κολπικούς στόχους, τον σχηματισμό συνάψεων και τη μυελίνωση – καθώς και ζητήματα ασφάλειας (ανοσολογική απόρριψη, κίνδυνος όγκου) και μεθόδους χορήγησης (ενδοϋαλοειδική έναντι υποαμφιβληστροειδικής έγχυσης). Τέλος, δίνουμε μια ρεαλιστική προοπτική για το πότε θα μπορούσαν να είναι εφικτές οι δοκιμές «πρώτης εφαρμογής σε ανθρώπους» για το γλαύκωμα και ποιες μετρήσεις αποτελεσμάτων θα απαιτούσαν. Σε όλη τη διάρκεια, επιδιώκουμε τη σαφήνεια: οι βασικοί όροι τονίζονται και τυχόν τεχνικές έννοιες εξηγούνται για ένα μη ειδικό κοινό.

Διαφοροποίηση RGCs από Ανθρώπινα Πολυδύναμα Βλαστοκύτταρα

Οι επιστήμονες έχουν αναπτύξει πολλά πρωτόκολλα για τη μετατροπή ανθρώπινων ESCs ή iPSCs σε νευρώνες τύπου RGC. Συνήθως, τα βλαστοκύτταρα καθοδηγούνται πρώτα σε κατάσταση προγονικού αμφιβληστροειδούς χρησιμοποιώντας συνδυασμούς αυξητικών παραγόντων και μικρών μορίων που μιμούνται την ανάπτυξη του ματιού (για παράδειγμα, ρυθμιστές των οδών FGF, IGF, BMP, Wnt και Notch) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Υπό τις κατάλληλες συνθήκες, αυτά τα κύτταρα θα διαφοροποιηθούν περαιτέρω σε RGCs, κάτι που μπορεί να επιβεβαιωθεί από τους δείκτες RGC. Βασικοί δείκτες περιλαμβάνουν τους μεταγραφικούς παράγοντες BRN3B (POU4F2) και ISL1, την πρωτεΐνη δέσμευσης RNA RBPMS, την νευρωνική κυτταροσκελετική πρωτεΐνη β-III tubulin (TUJ1), και την α-συνουκλεΐνη-γ (SNCG). Πράγματι, μία μελέτη έδειξε καλλιέργειες προερχόμενες από PSCs να εκφράζουν πολλαπλούς δείκτες RGC: «μεταγραφικοί παράγοντες όπως οι BRN3, ISL1 και SNCG» εμφανίστηκαν μαζί με μακριές νευρίτες, επιβεβαιώνοντας την ταυτότητα RGC (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Αυτά τα RGCs προερχόμενα από βλαστοκύτταρα μοιάζουν με τα φυσικά τους αντίστοιχα στην έκφραση γονιδίων και τη μορφολογία, αναπτύσσοντας μακριές προεκβολές και εκπέμποντας δυναμικά ενέργειας.

Τα RGCs δεν είναι ένας ομοιόμορφος κυτταρικός τύπος. Υπάρχουν δεκάδες υποτύποι RGC (π.χ. κύτταρα ευαίσθητα στην κίνηση με επιλεκτική κατεύθυνση, κύτταρα on/off κέντρου, εγγενώς φωτοευαίσθητα κύτταρα με μελανοψίνη, άλφα-RGCs, κ.λπ.), καθένας με ξεχωριστές λειτουργίες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ζωικές μελέτες έχουν καταγράψει 30+ υποτύπους RGC με βάση την ανατομία και τους μοριακούς δείκτες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), και στοιχεία υποδεικνύουν ότι οι άνθρωποι έχουν περίπου 20 ή περισσότερους υποτύπους με μοναδικές συνδεσιμότητες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Θεωρητικά, τα πρωτόκολλα βλαστοκυττάρων θα μπορούσαν να ρυθμιστούν για να παράγουν συγκεκριμένους υποτύπους προσαρμόζοντας τα αναπτυξιακά ερεθίσματα. Στην πράξη, οι περισσότερες τρέχουσες μέθοδοι στοχεύουν σε έναν μεικτό πληθυσμό RGC. Οι ερευνητές στη συνέχεια επαληθεύουν την ποικιλομορφία των υποτύπων με συν-χρώση για συνδυασμούς δεικτών: για παράδειγμα, μία μελέτη διαφοροποίησης ανθρώπινων RGCs εντόπισε υποψήφια on–off RGCs με επιλεκτική κατεύθυνση (που εκφράζουν CART) και άλφα-RGCs (που εκφράζουν SPP1/οστεοποντίνη) εντός των κυττάρων τους που εκφράζουν BRN3+ (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Η βελτιστοποίηση της ειδικότητας του υποτύπου είναι ένας ενεργός τομέας έρευνας, καθώς κάθε υπότυπος RGC (με τους δικούς του προ- και μετα-συναπτικούς εταίρους) θα χρειαστεί κατάλληλη ενσωμάτωση in vivo (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Η αποτελεσματικότητα και η ταχύτητα της παραγωγής RGC έχουν βελτιωθεί. Τα πρώιμα πρωτόκολλα διαρκούσαν αρκετές εβδομάδες ή μήνες, αλλά νεότερες μέθοδοι επιταχύνουν τη διαδικασία. Για παράδειγμα, οι Luo et al. δημιούργησαν υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα NGN2 συν ένα νευροτροφικό μέσο για την παραγωγή νευρώνων τύπου RGC σε μόλις δύο εβδομάδες, σε σύγκριση με 1-2 μήνες σε προηγούμενες 2D ή 3D καλλιέργειες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν δείκτες RGC και, όταν μεταμοσχεύθηκαν σε ενήλικα μάτια αρουραίων, «μετανάστευσαν επιτυχώς στο στρώμα των γαγγλιακών κυττάρων σε 1 εβδομάδα» (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ομοίως, πολυδύναμα βλαστοκύτταρα που καλλιεργούνται ως 3D αμφιβληστροειδικά οργανοειδή (τα οποία αναπαριστούν την ανάπτυξη του ματιού) παράγουν φυσικά RGCs μαζί με άλλους αμφιβληστροειδικούς νευρώνες. Τα RGCs που προέρχονται από οργανοειδή τείνουν να έχουν προφίλ γονιδιακής έκφρασης πλησιέστερα στα εμβρυϊκά RGCs από ό,τι οι 2D καλλιέργειες, και πολλές ομάδες πλέον συλλέγουν κύτταρα εμπλουτισμένα με RGC από οργανοειδή για πειράματα μεταμόσχευσης (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Παρά αυτή την πρόοδο, οι αποδόσεις παραμένουν μέτριες και οι καλλιέργειες είναι ετερογενείς. Τα πρωτόκολλα συχνά παράγουν έναν μεικτό πληθυσμό αμφιβληστροειδικών κυττάρων με μια μειονότητα RGCs, και η επιβίωση στην καλλιέργεια μπορεί να είναι περιορισμένη (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Οι ερευνητές χρησιμοποιούν συνήθως διαλογή κυττάρων (π.χ. αναφορείς Thy1 ή BRN3) για την καθαροποίηση των RGCs πριν από τη μεταμόσχευση. Ένας βασικός στόχος είναι η επίτευξη πολύ υψηλής καθαρότητας, επειδή τυχόν αδιαφοροποίητα ή εκτός στόχου κύτταρα κινδυνεύουν να σχηματίσουν όγκους. Μια πρόσφατη μελέτη προειδοποίησε ότι «για μεταφραστικές μελέτες θα είναι κρίσιμο να προσδιοριστεί η καθαρότητα των δότη RGCs για τη μείωση του κινδύνου σχηματισμού τερατώματος» (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Μεταμόσχευση σε Ζωικά Μοντέλα: Επιβίωση και Ενσωμάτωση

Αρκετές προκλινικές μελέτες έχουν πλέον δοκιμάσει ανθρώπινα RGCs προερχόμενα από βλαστοκύτταρα σε ζωικά μοντέλα. Οι στόχοι περιλαμβάνουν την απόδειξη ότι τα μεταμοσχευμένα RGCs μπορούν να επιβιώσουν, να ενσωματωθούν στον αμφιβληστροειδή του ξενιστή, να αναπτύξουν άξονες και (τελικά) να μεταδώσουν σήματα. Πειράματα έχουν γίνει κυρίως σε τρωκτικά (ποντίκια, αρουραίους), αλλά και σε μεγαλύτερα ζώα (γάτες) και μη ανθρώπινα πρωτεύοντα.

Μετά τη διαφοροποίηση ή την απομόνωση των RGCs in vitro, οι ερευνητές τα χορηγούν στο μάτι του ξενιστή. Δύο βασικές στρατηγικές είναι η ενδοϋαλοειδική έγχυση (έγχυση κυττάρων στο υαλοειδές, την εσωτερική κοιλότητα του ματιού) ή η υποαμφιβληστροειδική χορήγηση (τοποθέτηση κυττάρων κάτω από τον αμφιβληστροειδή). Τα αποτελέσματα ποικίλλουν:

- Η ενδοϋαλοειδική έγχυση είναι τεχνικά απλή για τη στόχευση των RGCs (τα οποία βρίσκονται στην εσωτερική επιφάνεια του αμφιβληστροειδούς). Αρκετές ομάδες έχουν εγχύσει ενδοϋαλοειδικά εναιώρημα ανθρώπινων RGCs ή RGCs προερχόμενων από οργανοειδή αμφιβληστροειδούς στο υαλοειδές τρωκτικών. Για παράδειγμα, οι Vrathasha et al. έγχυσαν περίπου 50.000 ανθρώπινα iPSC-RGCs ενδοϋαλοειδικά σε ποντίκια WS και διαπίστωσαν ότι τα μεταμοσχευμένα κύτταρα εντοπίστηκαν εντός του στρώματος των γαγγλιακών κυττάρων και επιβίωσαν για τουλάχιστον πέντε μήνες μετά τη μεταμόσχευση (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Αυτά τα κύτταρα ανέπτυξαν φυσιολογικά δενδριτικά δέντρα και προκάλεσαν δυναμικά ενέργειας που προκαλούνται από το φως, σχεδόν πανομοιότυπα με τα εγγενή RGCs ποντικού (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), αποδεικνύοντας ότι θα μπορούσαν να ενσωματωθούν λειτουργικά τουλάχιστον στον αμφιβληστροειδή. Οι Luo et al. (2020) ομοίως έδειξαν ότι κύτταρα τύπου RGC προερχόμενα από hESC (που υπερεκφράζουν NGN2) μετανάστευσαν στο στρώμα των γαγγλιακών κυττάρων ενήλικων αρουραίων εντός μιας εβδομάδας (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Αυτά τα αποτελέσματα είναι ενθαρρυντικά, αλλά ο αριθμός των κυττάρων που πραγματικά ενσωματώνονται είναι γενικά μικρός. Οι Vrathasha ανέφεραν κατά μέσο όρο ~672 επιζώντα κύτταρα δότη ανά αμφιβληστροειδή ποντικού (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) – ένα μικροσκοπικό κλάσμα των φυσιολογικών αριθμών RGC – τονίζοντας το προκλητικό περιβάλλον.

Ένα πρόβλημα με τις απλές ενδοϋαλοειδικές αναρτήσεις είναι ότι τα κύτταρα συχνά συσσωρεύονται ή αδυνατούν να προσκολληθούν. Σε ένα μοντέλο τραυματισμού RGC σε γάτα, οι Becker et al. διαπίστωσαν ότι η ενδοϋαλοειδική έγχυση εναιωρήματος κυττάρων οδήγησε σε συσσώρευση κυττάρων και μικρή πραγματική ενσωμάτωση (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Σημείωσαν ότι η χρήση ικριώματος θα μπορούσε να βελτιώσει την επιβίωση και τη μετανάστευση στον αμφιβληστροειδή. Πράγματι, ορισμένες μελέτες ενσωματώνουν πλέον RGCs σε ικριώματα βιοϋλικών ή ιστό οργανοειδών για την υποστήριξή τους. Για παράδειγμα, ανθρώπινα αμφιβληστροειδικά οργανοειδή (συλλέγοντας RGCs στην αναπτυξιακή ημέρα 60–70) μεταμοσχεύθηκαν υποαμφιβληστροειδικά σε μάτια αιλουροειδών. Με συστηματική ανοσοκαταστολή, αυτά τα μοσχεύματα οργανοειδών επέζησαν τουλάχιστον 1 μήνα και φάνηκε να σχηματίζουν συναπτικές επαφές με νευρώνες του ξενιστή (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Η υποαμφιβληστροειδική προσέγγιση εξασφάλισε σταθερή επαφή μεταξύ του ιστού του δότη και του αμφιβληστροειδούς, ενώ τα ενδοϋαλοειδικά εναιωρήματα κυττάρων είχαν την τάση να επιπλέουν ή να συσσωρεύονται. Από την άλλη πλευρά, η υποαμφιβληστροειδική χορήγηση είναι μια πιο πολύπλοκη χειρουργική επέμβαση και μπορεί να περιορίζεται από τον διαθέσιμο χώρο (ο υποαμφιβληστροειδικός χώρος είναι λεπτός σε τετράποδα και πρωτεύοντα).

Στα μικρά τρωκτικά, η ενδοϋαλοειδική χορήγηση παραμένει η πιο κοινή προσέγγιση. Μετά την έγχυση, επιτυχημένα κύτταρα δότη έχουν αναγνωριστεί να μεταναστεύουν στο στρώμα των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς του ξενιστή και να εκφράζουν δείκτες RGC (BRN3, RBPMS) για εβδομάδες έως μήνες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ορισμένες μελέτες αναφέρουν ότι τα κύτταρα του δότη αναπτύσσουν νέες δενδρίτες και ακόμη και αρχικούς αξονικούς βλαστούς προς την κεφαλή του οπτικού νεύρου. Για παράδειγμα, μεταμοσχευμένα hiPSC-RGCs σε ποντίκια έδειξαν περίτεχνα δενδριτικά δέντρα και (όταν διεγέρθηκαν από το φως) παρήγαγαν μετασυναπτικά δυναμικά, υποδεικνύοντας ότι είχαν σχηματίσει συνάψεις με διπολικούς/αμακρινικούς ενδιάμεσους νευρώνες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ωστόσο, είναι σημαντικό να είμαστε προσεκτικοί: οι εμπειρίες με μεταμοσχεύσεις φωτοϋποδοχέων δείχνουν ότι οι μεταφερόμενοι φθορίζοντες δείκτες μπορούν μερικές φορές να δίνουν την εντύπωση ότι τα κύτταρα του μοσχεύματος έχουν ενσωματωθεί, ενώ στην πραγματικότητα μεταβίβασαν απλώς χρωστική στα κύτταρα του ξενιστή (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Απαιτείται αυστηρή σήμανση και λειτουργική δοκιμή για την επιβεβαίωση της πραγματικής ενσωμάτωσης. Σε όλες τις περιπτώσεις μέχρι στιγμής, μόνο ένα υποσύνολο των εγχυθέντων RGCs επιβιώνει και ενσωματώνεται. Για παράδειγμα, οι Vrathasha et al. έγχυσαν 500.000 κύτταρα, αλλά αργότερα μέτρησαν μόνο ~0,13% (περίπου 650 κύτταρα) ως επιζώντα στους 5 μήνες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Σαφώς, το περιβάλλον του αμφιβληστροειδούς του ξενιστή επιβάλλει ισχυρές επιλεκτικές πιέσεις, και η επιβίωση παραμένει ένας περιοριστικός παράγοντας.

Οδοί Χορήγησης: Ενδοϋαλοειδική έναντι Υποαμφιβληστροειδικής

Η επιλογή του τρόπου χορήγησης των RGCs στο μάτι έχει πρακτικές και βιολογικές επιπτώσεις. Οι ενδοϋαλοειδικές ενέσεις τοποθετούν τα κύτταρα στο υαλοειδές του ματιού (τζελ) δίπλα στον αμφιβληστροειδή. Αυτή η οδός λούζει άμεσα τον εσωτερικό αμφιβληστροειδή, αλλά μπορεί επίσης να εκθέσει τα κύτταρα σε προβλήματα διάχυσης (πρέπει να προσκολληθούν στην επιφάνεια του αμφιβληστροειδούς για να ενσωματωθούν). Όπως σημειώθηκε παραπάνω, τα εναιωρήματα κυττάρων χωρίς υποστήριξη μπορούν να συσσωρευτούν· η επιβίωση μπορεί να είναι φτωχή εκτός εάν τα κύτταρα μεταναστεύσουν γρήγορα στον ιστό του ξενιστή. Αρκετές μελέτες έχουν διαπιστώσει ότι τα μοσχεύματα με ικριώματα ή με βάση οργανοειδή (αντί για εναιωρήματα μεμονωμένων κυττάρων) βελτιώνουν τα αποτελέσματα (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Η ενδοϋαλοειδική χορήγηση έχει το πλεονέκτημα της σχετικά απλής τεχνικής (χρησιμοποιείται ήδη για ενέσεις φαρμάκων και φορείς γονιδιακής θεραπείας) και της άμεσης στόχευσης των RGCs.

Αντίθετα, η υποαμφιβληστροειδική χορήγηση (τοποθέτηση κυττάρων μεταξύ του αμφιβληστροειδούς και του μελαγχρωματικού επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς) χρησιμοποιείται παραδοσιακά για μεταμοσχεύσεις φωτοϋποδοχέων ή RPE. Για μεταμοσχεύσεις RGCs είναι λιγότερο διαισθητική, αλλά μπορεί να προσφέρει πλεονεκτική επαφή. Στη μελέτη σε αιλουροειδή από τους Singh et al., ανθρώπινα αμφιβληστροειδικά οργανοειδή εμφυτεύτηκαν υποαμφιβληστροειδικά με στενή προσκόλληση στον αμφιβληστροειδή του ξενιστή. Παρά την ανάγκη για ανοσοκαταστολή, αυτά τα μοσχεύματα επέζησαν για εβδομάδες και έδειξαν σημάδια σχηματισμού συνάψεων με τα γαγγλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ο στενός υποαμφιβληστροειδικός χώρος διατήρησε τα κύτταρα του δότη στη θέση τους. Ωστόσο, σε γάτες και πρωτεύοντα αυτός ο χώρος είναι εξαιρετικά λεπτός, καθιστώντας τη στόχευση δύσκολη. Η υποαμφιβληστροειδική χειρουργική φέρει επίσης υψηλότερο κίνδυνο για τον αμφιβληστροειδή του ξενιστή. Έτσι, η ενδοϋαλοειδική έγχυση παραμένει η τυπική προσέγγιση στα τρωκτικά, ενώ οι υποαμφιβληστροειδικές ή επιαμφιβληστροειδικές (πάνω στην επιφάνεια του αμφιβληστροειδούς) στρατηγικές μπορεί να εξερευνηθούν σε μεγαλύτερα μάτια.

Συνοψίζοντας, η ενδοϋαλοειδική έγχυση είναι η ευκολότερη, αλλά συχνά απαιτεί ικριώματα ή μεγάλο αριθμό κυττάρων για οποιαδήποτε επιβίωση (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Τα υποαμφιβληστροειδικά μοσχεύματα/συστάδες μπορούν να επιτύχουν σταθερή επαφή (όπως στη μελέτη της γάτας από τον Singh (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)), αλλά θέτουν χειρουργικές προκλήσεις. Και οι δύο οδοί διερευνώνται, και είναι πιθανό ότι μελλοντικά πρωτόκολλα θα συνδυάσουν την ενσωμάτωση κυττάρων σε βιοσυμβατά ικριώματα ή γέλες για τη μεγιστοποίηση της διασύνδεσης δότη-ξενιστή.

Εμπόδια στην Αναγέννηση και τη Συνδεσιμότητα των Αξόνων

Ακόμη και αν τα μεταμοσχευμένα RGCs επιβιώσουν και τοποθετηθούν στο μάτι, σημαντικά εμπόδια εμποδίζουν την ικανότητά τους να μεταδίδουν την όραση στον εγκέφαλο. Σε ένα φυσιολογικό (ενήλικο) κεντρικό νευρικό σύστημα, οι τραυματισμένες οπτικές νευρικές ίνες δεν αναπτύσσονται καλά. Τα μεταμοσχευμένα RGCs αντιμετωπίζουν το ίδιο εχθρικό περιβάλλον. Βασικά εμπόδια περιλαμβάνουν:

Ανάπτυξη Άξονα μέσω της Lamina Cribrosa

Η lamina cribrosa είναι μια δομή που μοιάζει με κόσκινο στην κεφαλή του οπτικού νεύρου, από όπου οι άξονες των RGCs εξέρχονται από το μάτι. Αποτελεί ένα σημαντικό σημείο συμφόρησης για την αναγέννηση. Σε πειράματα σε ζώα, οι ερευνητές διαπιστώνουν ότι λίγοι άξονες μεταμοσχευμένων RGCs διασχίζουν αυτό το φράγμα. Μία προσεκτική μελέτη ανέφερε ότι «όταν τα RGCs εγχύθηκαν στο υαλοειδές, λίγα ενσωματώθηκαν στον αμφιβληστροειδή. Από τα RGCs που ενσωματώθηκαν επιτυχώς στο GCL, πολλά ανέπτυξαν άξονες που αναπτύχθηκαν προς την κεφαλή του οπτικού νεύρου, αλλά λίγα αναπτύχθηκαν πέρα από τη lamina cribrosa (~10%)» (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Με άλλα λόγια, το 90% των νέων αξόνων σταμάτησε στην lamina. Η lamina περιέχει πυκνό γλοιακό και εξωκυττάριο πλέγμα που πιθανότατα παράγει ανασταλτικά σήματα και φυσικά εμπόδια. Η υπέρβαση αυτού του εμποδίου μπορεί να απαιτεί είτε τη μηχανική επεξεργασία των αξόνων του δότη (για παράδειγμα, με την αύξηση της ρύθμισης των οδών προ-ανάπτυξης όπως το mTOR ή το Wnt) είτε την τροποποίηση του περιβάλλοντος της lamina (για παράδειγμα, την εφαρμογή ενζύμων ή την εξουδετέρωση ανασταλτικών μορίων). Αυτό το πρόβλημα είναι ανάλογο με οποιονδήποτε τραυματισμό του νωτιαίου μυελού: την ιδιότητα του ΚΝΣ για αποτυχία αναγέννησης αξόνων. Υποδηλώνει ότι ακόμη και αν τοποθετήσουμε RGCs στο μάτι, η είσοδος των αξόνων τους στο οπτικό νεύρο θα απαιτήσει πολύ ισχυρά προ-αναγεννητικά ερεθίσματα.

Καθοδήγηση προς Εγκεφαλικούς Στόχους

Υποθέτοντας ότι οι άξονες των RGCs μπορούν να εξέλθουν από το μάτι, η επόμενη πρόκληση είναι η καθοδήγηση των αξόνων σε μεγάλες αποστάσεις προς τους σωστούς στόχους (κυρίως τον πλάγιο γονατώδη πυρήνα (LGN) στον θάλαμο και το άνω κολπίο στο μεσεγκέφαλο). Κατά την ανάπτυξη, οι άξονες των RGCs καθοδηγούνται από μοριακές κλίσεις (π.χ. πρωτεΐνες εφρίνης-Α/EphA) και αυθόρμητη αμφιβληστροειδική δραστηριότητα. Οι εγκέφαλοι των ενηλίκων γενικά στερούνται αυτών των ενδείξεων. Ορισμένες μελέτες σε τρωκτικά έχουν δείξει ότι είναι δυνατό να κατευθυνθούν οι αναγεννώμενοι άξονες των RGCs να επανασυνδεθούν με το άνω κολπίο: για παράδειγμα, ένα μοντέλο βλάβης του οπτικού τράκτου ρύθμισε ανοδικά γονίδια προ-ανάπτυξης (mTOR, JAK/STAT) και παρατήρησε νέες συνάψεις στο κολπίο (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ωστόσο, αυτοί οι αναγεννημένοι άξονες δεν αποκατέστησαν την όραση εκτός εάν υποστηρίχθηκαν τεχνητά (βλ. μυελίνωση παρακάτω). Εν ολίγοις, η εύρεση των σωστών σημάτων καθοδήγησης (ή η παροχή τους) είναι ένα ανοιχτό ερευνητικό ερώτημα. Οι μεταμοσχευμένοι άξονες των RGCs θα αναπαρήγαγαν ιδανικά τις εμβρυϊκές ενδείξεις καθοδήγησης για να σχηματίσουν τον σωστό αμφιβληστροειδοτοπικό χάρτη στον εγκέφαλο, αλλά παραμένει ασαφές πώς να επιτευχθεί αυτό στους ενήλικες.

Σχηματισμός Συνάψεων

Οι νέοι άξονες πρέπει τελικά να σχηματίσουν συνάψεις με τους σωστούς νευρώνες-στόχους. Ενθαρρυντικά, στοιχεία υποδεικνύουν ότι τα μεταμοσχευμένα RGCs μπορούν να σχηματίσουν συναπτικές συνδέσεις τουλάχιστον εντός του αμφιβληστροειδούς. Στη μελέτη των Johnson et al., τα RGCs που προέρχονται από hiPSC και μετανάστευσαν στο GCL του ξενιστή ανέπτυξαν φυσιολογικά δενδριτικά δέντρα. Χρησιμοποιώντας χρώση συναπτικών δεικτών και διέγερση με φως, οι συγγραφείς «απέδειξαν τον σχηματισμό νέων και λειτουργικών συνάψεων μεταξύ των RGCs του δότη και του αμφιβληστροειδούς του ξενιστή» (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Με άλλα λόγια, τα μεταμοσχευμένα RGCs μπόρεσαν να συνδεθούν με διπολικούς/αμακρινικούς ενδιάμεσους νευρώνες και να μεταδώσουν σήματα σε κατάντη κύτταρα του ξενιστή, αν και οι αποκρίσεις ήταν κάπως ασθενέστερες από τα εγγενή κύτταρα. Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι, τουλάχιστον στο επίπεδο του εσωτερικού αμφιβληστροειδούς, μπορεί να συμβεί κατάλληλη καλωδίωση.

Ο σχηματισμός συνάψεων στον εγκέφαλο είναι ακόμη πιο δύσκολο να επιτευχθεί και να μετρηθεί. Ορισμένες μελέτες αναγέννησης (όχι μεταμόσχευσης per se) έχουν προκαλέσει την επαν-ανάπτυξη των αξόνων των RGCs προς το κολπίο και τον σχηματισμό συνάψεων (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Στο μοντέλο βλάβης του οπτικού τράκτου που αναφέρθηκε παραπάνω, οι νέοι άξονες στην υπερχιασματική/κολπική περιοχή σχημάτισαν συνάψεις, αλλά τα ποντίκια εξακολουθούσαν να μην έχουν μετρήσιμη οπτική συμπεριφορά. Αυτό αποδόθηκε αργότερα σε έλλειψη μυελίνης (βλ. επόμενη ενότητα) και όχι σε ελαττωματικές συνάψεις (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Συνοπτικά: Η συναπτογένεση είναι δυνατή κατ' αρχήν, αλλά η διασφάλιση ισχυρών, ακριβώς στοχευμένων συνάψεων που αποκαθιστούν την όραση είναι ένα σημαντικό εμπόδιο. Πιθανότατα θα απαιτηθούν ενδείξεις «αναπτυξιακού τύπου», όπως η διαμορφωμένη διέγερση με φως (αμφιβληστροειδικά κύματα) ή η συν-μεταμόσχευση υποστηρικτικών γλοιακών κυττάρων, για την καθοδήγηση και την ενίσχυση νέων συνδέσεων.

Μυελίνωση Αναγεννημένων Αξόνων

Τέλος, οι άξονες των RGCs συνήθως μυελινώνονται μόνο αφού περάσουν μέσω της lamina cribrosa – ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό σχεδιασμού του ματιού. Οι ολιγοδενδροκύτταρα (τα κύτταρα μυελίνωσης του ΚΝΣ) κρατούνται έξω από τον αμφιβληστροειδή από την lamina (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Εάν ο άξονας ενός μεταμοσχευμένου RGC εξέλθει από το μάτι, εισέρχεται στο ΚΝΣ, το οποίο έχει γλοιακά κύτταρα που μυελινώνουν. Ωστόσο, σε πολλές πειραματικές περιπτώσεις οι νέοι άξονες παραμένουν αμυελίνωτοι. Αυτό έχει σημασία επειδή οι αμυελίνωτοι μακροί άξονες του ΚΝΣ μεταδίδουν παλμούς πολύ άσχημα. Στη μελέτη αναγέννησης του οπτικού τράκτου (που περιγράφεται παραπάνω), οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι οι νεοσχηματισμένοι άξονες ήταν αμυελίνωτοι, και τα ποντίκια δεν έδειξαν οπτική βελτίωση εκτός εάν τους χορηγήθηκε 4-αμινοπυριδίνη (4-AP) – ένα φάρμακο που μπλοκάρει τους διαύλους καλίου και ενισχύει την αγωγιμότητα σε απομυελινωμένες ίνες (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ουσιαστικά, η 4-AP αποκατέστησε εν μέρει την όραση αντισταθμίζοντας την έλλειψη μυελίνης. Αυτό το αποτέλεσμα υπογραμμίζει το εξής: ακόμη και αν ένας άξονας RGC φτάσει στον στόχο του, χωρίς μυελίνη δεν θα μεταδώσει σήματα αρκετά γρήγορα για την όραση. Η διασφάλιση της σωστής μυελίνωσης – ίσως με συν-μεταμόσχευση προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων ή διέγερση των γλοιακών κυττάρων του ξενιστή – θα είναι κρίσιμη.

Συνοψίζοντας, τα μεταμοσχευμένα RGCs αντιμετωπίζουν ένα δύσκολο έργο: μόνο λίγα αναπτύσσονται πέρα από τη lamina cribrosa (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), πρέπει να βρουν τον σωστό διάδρομο προς τους εγκεφαλικούς στόχους, να δημιουργήσουν κατάλληλες συνάψεις και στη συνέχεια να περιβληθούν από μυελίνη. Κάθε βήμα έχει προς το παρόν μόνο μερική επιτυχία σε ζωικά μοντέλα. Η υπέρβαση αυτών των εμποδίων είναι ένας ενεργός τομέας έρευνας στην νευροαναγέννηση.

Ανοσολογικές Προκλήσεις και Προκλήσεις Ασφάλειας

Το μάτι είναι σχετικά ανοσολογικά προνομιούχο, αλλά η μεταμόσχευση κυττάρων εξακολουθεί να ενέχει κίνδυνο ανοσολογικής επίθεσης. Εάν τα κύτταρα του δότη είναι αυτόλογα (από τα δικά iPSCs του ασθενούς), η απόρριψη είναι ελάχιστη, αλλά η τεχνική πολυπλοκότητα είναι υψηλή. Τα αλλογενή κύτταρα (από άλλο δότη ή μια γραμμή βλαστοκυττάρων) είναι ευκολότερα στην παραγωγή, αλλά μπορεί να δεχθούν επίθεση από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Σε ζωικές μελέτες, οι ερευνητές χρησιμοποιούν συχνά ανοσοκατασταλτικά φάρμακα για να προωθήσουν την επιβίωση του μοσχεύματος. Για παράδειγμα, στη μελέτη μεταμόσχευσης οργανοειδών σε γάτες, απαιτήθηκε συστηματική ανοσοκαταστολή για την επιβίωση και τον σχηματισμό συνδέσεων του μοσχεύματος (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Χωρίς ανοσοκαταστολή, τα ξενογενή κύτταρα απομακρύνονται γρήγορα. Ενδιαφέροντα, οι περισσότερες προκλινικές μελέτες μεταμοσχεύσεων αμφιβληστροειδούς αναφέρουν μόνο χαμηλού βαθμού φλεγμονή αντί για πλήρη απόρριψη – ένα όφελος των φραγμών του ματιού (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ωστόσο, η μακροπρόθεσμη επιτυχία θα απαιτήσει πιθανότατα είτε παροδική ανοσοκαταστολή είτε προηγμένες τεχνικές (όπως η «κάλυψη» κυττάρων με ανοσοαποφευκτικές επιστρώσεις) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Οποιαδήποτε μελλοντική δοκιμή σε ανθρώπους θα πρέπει να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα, ώστε τα RGCs του δότη να μην καταστραφούν από τα Τ-κύτταρα του ξενιστή.

Μια σχετική ανησυχία είναι η ογκογένεση. Τα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα μπορούν να σχηματίσουν τερατώματα εάν μεταμοσχευθούν αδιαφοροποίητα κύτταρα. Ακόμη και ένας μικρός αριθμός μολυσματικών PSCs στην παρασκευή των RGCs θα μπορούσε να είναι καταστροφικός. Έτσι, οι ερευνητές τονίζουν την υψηλή καθαρότητα του μεταμοσχευμένου πληθυσμού. Οι Vrathasha et al. σημειώνουν ότι είναι «κρίσιμο να προσδιοριστεί η καθαρότητα των δότη RGCs για τη μείωση του κινδύνου σχηματισμού τερατώματος» (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Αυτό απαιτεί ενδελεχή ποιοτικό έλεγχο – για παράδειγμα, διαλογή κυττάρων μέσω αναφορέων ειδικών για RGCs ή χρήση κυτταρομετρίας ροής, και δοκιμή με μεθυλίωση γονιδιώματος ή δοκιμασίες γονιδιακής έκφρασης για να διασφαλιστεί ότι δεν παραμένουν πολυδύναμα κύτταρα (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Μέχρι στιγμής, δεν έχουν αναφερθεί όγκοι στα πειράματα μεταμόσχευσης RGC σε μικρά ζώα, αλλά η κλινική μετάφραση θα απαιτήσει εξαιρετικά αυστηρή καθαροποίηση και δοκιμές απελευθέρωσης οποιουδήποτε προϊόντος βλαστοκυττάρων.

Προοπτική: Προς Ανθρώπινες Δοκιμές για το Γλαύκωμα

Δεδομένων των τεράστιων προκλήσεων που αναφέρθηκαν παραπάνω, πότε θα μπορούσε κανείς να αναμένει λογικά μια πρώτη κλινική δοκιμή αντικατάστασης RGC σε ασθενείς με γλαύκωμα; Δυστυχώς, η απάντηση είναι πιθανότατα «όχι σύντομα». Ο τομέας βρίσκεται ακόμη σε πρώιμα προκλινικά στάδια (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Μέχρι σήμερα, καμία ανθρώπινη δοκιμή δεν έχει καταγραφεί ειδικά για τη μεταμόσχευση RGC στο γλαύκωμα. Οι υπάρχουσες «κλινικές βλαστοκυττάρων» (για παράδειγμα, παραπλανητικές δοκιμές αυτόλογων κυττάρων λίπους ή μυελού των οστών) έχουν επικεντρωθεί σε ad hoc προσεγγίσεις και, κατάφωρα, έχουν προκαλέσει βλάβη (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Οι ασθενείς θα πρέπει να είναι επιφυλακτικοί απέναντι σε μη αποδεδειγμένες θεραπείες που παρακάμπτουν την επίβλεψη του FDA. Οι νόμιμες δοκιμές «πρώτης εφαρμογής σε ανθρώπους» θα απαιτούσαν σταθερή απόδειξη της αρχής σε ζώα, αντιμετωπίζοντας κάθε εμπόδιο, και ισχυρά δεδομένα ασφάλειας. Αυτό θα μπορούσε να πάρει πολλά χρόνια.

Μια πραγματιστική προοπτική είναι ότι οι μικρές δοκιμές ασφάλειας ενδέχεται να ξεκινήσουν στα τέλη της δεκαετίας του 2020 ή του 2030, αν η πρόγος συνεχιστεί. Οι υποψήφιοι θα ήταν πιθανώς ασθενείς με πολύ προχωρημένη νόσο (όπου ο αμφιβληστροειδής και το οπτικό νεύρο μπορεί να είναι σε μεγάλο βαθμό αποσυνδεδεμένα), ή αντίστροφα, εκείνοι σε μεσαίο στάδιο της νόσου (για να μεγιστοποιηθεί η πιθανότητα οποιουδήποτε οφέλους). Τα πρωταρχικά τελικά σημεία θα ήταν αρχικά η ασφάλεια: απουσία ανεπιθύμητων φλεγμονωδών αντιδράσεων ή σχηματισμού όγκων στο μάτι. Τα δευτερεύοντα τελικά σημεία θα στόχευαν στην ανίχνευση τυχόν ανατομικών ή λειτουργικών ενδείξεων «πρόσφυσης» του μοσχεύματος. Για παράδειγμα, η απεικόνιση του αμφιβληστροειδούς (οπτική τομογραφία συνοχής) θα μπορούσε να αναζητήσει πάχυνση του στρώματος νευρικών ινών του αμφιβληστροειδούς ή του στρώματος γαγγλιακών κυττάρων όπου εγχύθηκαν κύτταρα. Ηλεκτροφυσιολογικές δοκιμές, όπως το ηλεκτροαμφιβληστροειδογράφημα προκαλούμενων δυναμικών (PERG) ή τα οπτικά προκλητά δυναμικά (VEP), θα μπορούσαν να αποκαλύψουν ηλεκτρικές αποκρίσεις που προέρχονται από τα μεταμοσχευμένα κύτταρα. Τελικά, οι λειτουργικές δοκιμές όρασης (όπως τα οπτικά πεδία ή η ευαισθησία αντίθεσης) θα ήταν σημαντικές, αλλά ακόμη και η επίδειξη αποκατάστασης ενός μικρού τόξου όρασης θα ήταν πρωτοποριακή. Κατ' αναλογία, πρόσφατες δοκιμές γονιδιακής θεραπείας για κληρονομικές παθήσεις του αμφιβληστροειδούς μετρούν αποτελέσματα σε δομικές έναντι λειτουργικών κατηγοριών (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)· θα ίσχυαν παρόμοιες κατηγορίες (ανατομία OCT, ηλεκτροφυσιολογία, οπτική λειτουργία, όραση που αναφέρεται από τον ασθενή).

Συνοπτικά, ενώ υπάρχει συγκρατημένη αισιοδοξία, κάθε πρακτικό χρονοδιάγραμμα είναι μακροπρόθεσμο. Κάθε ένα από τα βήματα που περιγράφονται παραπάνω χρειάζεται βελτίωση. Μια ρεαλιστική πρώτη δοκιμή θα μπορούσε να σχεδιαστεί στα μέσα έως τέλη της δεκαετίας του 2030, εξαρτώμενη από ανακαλύψεις στην αναγέννηση των αξόνων και τα προφίλ ασφάλειας. Οι υποψήφιοι και τα τελικά σημεία θα επιλέγονταν προσεκτικά: πιθανώς πρώτα τελικά σημεία ασφάλειας, ακολουθούμενα από υποκατάστατα ενσωμάτωσης (απεικόνιση, ηλεκτροφυσιολογία) πριν αναμένονται μετρήσιμα κέρδη στην όραση. Με άλλα λόγια, ο τομέας πρέπει να εξισορροπήσει την ελπίδα με τον ρεαλισμό – η επιδίωξη της αντικατάστασης RGC θα είναι ένας μαραθώνιος έρευνας και όχι ένας γρήγορος αγώνας.

Συμπέρασμα

Η αντικατάσταση των χαμένων RGCs στο γλαύκωμα με αντίστοιχα που αναπτύσσονται στο εργαστήριο είναι μια συναρπαστική αλλά νεοσύστατη ιδέα. In vitro, τα ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα μπορούν να κατευθυνθούν σε κύτταρα τύπου RGC που εκφράζουν βασικούς δείκτες, ακόμη και ορισμένα χαρακτηριστικά υποτύπων (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Μελέτες μεταμόσχευσης σε ζώα έχουν δείξει ότι ένα κλάσμα αυτών των κυττάρων μπορεί να επιβιώσει για μήνες, να ενσωματωθεί στο νευρικό κύκλωμα του αμφιβληστροειδούς και ενδεχομένως να σχηματίσει συνάψεις (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ωστόσο, παραμένουν τεράστια εμπόδια. Η ανάπτυξη του άξονα πέρα από τη lamina cribrosa είναι φτωχή (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), η καθοδήγηση προς τους κεντρικούς στόχους είναι ανεπαρκώς ελεγχόμενη, οι συνάψεις είναι αδύναμες ή ανύπαρκτες, και οι άξονες στερούνται μυελίνης (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov). Επιπλέον, πρέπει να αντιμετωπιστούν η ανοσολογική απόρριψη και οι κίνδυνοι όγκων. Προς το παρόν, οι ερευνητές συνεχίζουν να αντιμετωπίζουν κάθε πρόκληση με τη σειρά της. Μέχρι να μπορέσουμε να αναπτύξουμε, να χορηγήσουμε και να συνδέσουμε αξιόπιστα RGCs από βλαστοκύτταρα, οι μεταμοσχεύσεις που αποκαθιστούν την όραση θα παραμείνουν στο εργαστήριο. Αλλά η σταθερή πρόοδος δίνει ένα μέτρο ελπίδας: με συνεχή καινοτομία και προσοχή, το όνειρο της αντικατάστασης RGC «από το τρυβλίο Petri στον οπτικό τράκτο» μπορεί μια μέρα να μετατραπεί από πείραμα σε θεραπεία.