Вступ

Втрата зору внаслідок пошкодження зорового нерва або глаукоми відбувається через неспроможність гангліозних клітин сітківки (ГКС) відновити свої аксони. У дорослих ссавців програма внутрішнього росту ГКС зазвичай вимкнена, тому пошкоджені нерви не загоюються самостійно (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Недавні дослідження на мишах показують, що генна терапія може відновити активність цих шляхів росту. Наприклад, видалення гена PTEN (гальмо росту клітин) у дорослих ГКС активує шлях росту mTOR і призводить до сильної регенерації аксонів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). У цій статті ми розглянемо, як маніпуляції з PTEN/mTOR, генами KLF-сімейства та Sox11 можуть стимулювати регенерацію аксонів ГКС, чого це дозволило досягти на мишах, питання безпеки (наприклад, ризик раку), як доставляються гени (вірусні вектори AAV, інтравітреальні або супрахоріоїдальні ін'єкції), а також які кроки необхідні для переходу від моделей гострого пошкодження до лікування хронічної глаукоми.

Внутрішні шляхи росту в ГКС

Шлях PTEN/mTOR

У нормальних умовах дорослі ГКС підтримують шлях mTOR переважно вимкненим, що обмежує їхню здатність до росту нових аксонів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). PTEN — це ген, який інгібує mTOR. Вчені виявили, що видалення PTEN у ГКС дорослих мишей вивільняє mTOR-сигналізацію та дозволяє регенерацію аксонів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). В одному знаковому дослідженні умовне нокаут-видалення PTEN у дорослих мишей призвело до потужної регенерації зорового нерва (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Приблизно 8–10% виживших ГКС протягнули аксони більш ніж на 0,5 мм за межі пошкодження, причому деякі аксони виросли понад 3 мм і навіть досягли перехрестя зорових нервів через 4 тижні після травми (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Видалення іншого гальма mTOR, гена TSC1, також індукувало регенерацію аксонів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Видалення PTEN не тільки стимулювало регенерацію, але й покращило виживання ГКС (близько 45% виживання проти ~20% у контрольних групах) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Однак існує проблема безпеки: PTEN є супресором пухлин. Довготривала втрата PTEN може сприяти неконтрольованому росту клітин. Дійсно, одне з головних досліджень регенерації зазначило, що постійне видалення PTEN було б клінічно неприйнятним через ризик раку (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Для вирішення цієї проблеми дослідники пропонують використовувати контрольовану генну терапію (наприклад, shRNA, доставлену AAV під керованим промотором), щоб активність PTEN можна було вимкнути під час регенерації, а потім знову увімкнути (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Коротше кажучи, PTEN/mTOR — це потужний внутрішній перемикач росту, але його необхідно ретельно контролювати.

Сімейство KLF та Sox11

Дослідники також націлилися на фактори транскрипції, які контролюють ріст аксонів. Крюппелеподібні фактори (KLF) є сімейством таких генів. Ключовим відкриттям є те, що KLF4 діє як гальмо росту аксонів: ГКС без KLF4 ростуть краще, ніж нормальні (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). У мишей, генетично модифікованих таким чином, що їхні ГКС не мали KLF4, ці нейрони утворювали набагато довші нейрити в культурі, а після роздавлювання зорового нерва виростало набагато більше аксонів. Наприклад, через два тижні після травми миші з нокаут-видаленням KLF4 мали значно більше регенеруючих волокон на відстані понад 1 мм від місця травми, ніж миші дикого типу (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Інші KLF мають різноманітні ролі: деякі (як KLF6 і KLF7) сприяють росту, тоді як інші (як KLF9) пригнічують його (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Таким чином, зміна балансу експресії KLF може зняти деякі з “гальм” розвитку росту ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Ще один фактор транскрипції — Sox11, важливий для розвитку. Надмірна експресія Sox11 у дорослих ГКС (з використанням генної доставки AAV) також сприяла регенерації. В одному дослідженні ГКС з додатковим Sox11 показали помітне збільшення регенерації аксонів після травми (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Однак Sox11 має змішані ефекти: він сприяє регенерації у певних типах ГКС, але може вбивати інші. Зокрема, надмірна експресія Sox11 знищила майже всі так звані «альфа» ГКС (підтип ГКС), які зазвичай добре реагують на лікування на основі PTEN (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Іншими словами, Sox11 перепрограмує деякі ГКС у стан, здатний до росту, але також шкодить іншим (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Вчені роблять висновок, що різні підтипи ГКС потребують різних стратегій регенерації.

Ключові дослідження роздавлювання зорового нерва на мишах

Моделі пошкодження зорового нерва у мишей (роздавлювання зорового нерва) продемонстрували, як ці генні маніпуляції працюють на практиці. Класичний підхід поєднував шляхи для максимального ефекту. В одному дослідженні PNAS вчені застосували три методи лікування: видалення PTEN, індукцію запалення в оці (зимозан) та підвищення рівня цАМФ. Ця трійця спонукала ГКС регенерувати аксони через весь зоровий нерв і в зорові центри мозку (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Коли вони досліджували мозок лікованих мишей, багато регенеруючих волокон досягали латерального колінчастого тіла, верхніх горбків та інших зорових ділянок (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Важливо, що ця регенерація призвела до часткового відновлення поведінки, пов'язаної із зором. Ліковані миші відновили деяку здатність виконувати прості зорові завдання: вони могли відстежувати рухомі патерни (оптомоторний рефлекс) та краще оцінювати глибину, ніж контрольні пошкоджені тварини (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). (Вони навіть показали кращі циркадні світлові реакції [20†L33-L38], хоча ці деталі важко виміряти.) Ця робота продемонструвала, що регенерація аксонів на великі відстані у дорослих мишей може функціонально відновити зв'язок частин зорової системи.

Інші дослідження зосереджувалися на окремих факторах. Інтравітреальне введення AAV, що містить конститутивно активний TrkB (рецептор нейротрофічного фактора мозку), спричинило ще довший ріст. Наприклад, Нішиджима та співавт. використовували сконструйований TrkB (названий F-iTrkB), доставлений AAV, і спостерігали регенерацію аксонів на понад 4,5 мм, причому деякі досягали зорового перехрестя (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Аналогічно, введення гена, що сприяє росту, такого як активний K-Ras (відомий онкоген), у ГКС забезпечило близько 3 мм регенерації (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Цікаво, що пухлин в очах, що пройшли лікування, не спостерігалося, але автори все ж рекомендують використовувати індуковані перемикачі генів для безпеки (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Ці та інші дослідження підтверджують, що увімкнення генів внутрішнього росту дійсно може стимулювати регенерацію в моделях пошкодження зорового нерва у мишей.

Часткове відновлення зору

Експерименти на мишах часто відстежували не лише анатомію, а й функцію. Оптомоторний рефлекс (миші, що слідують за рухомими смугами) та тести на сприйняття глибини є простими способами перевірити, чи покращується зір. У дослідженні з потрійним лікуванням (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) миші показали часткове відновлення цих рефлексів. Вони могли знову реагувати на рухомі візуальні образи та оцінювати глибину, тоді як пошкоджені миші без лікування цього не могли (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Це надихає: це означає, що регенеруючі аксони утворили корисні зв'язки. Однак відновлення було лише частковим. Багато зорових шляхів (особливо тонкий зір, що формує зображення) залишаються роз'єднаними. Досі регенерація відновила базові зорові реакції, але не повний зір. Проте, будь-яке функціональне покращення підтверджує потенціал цих стратегій.

Міркування щодо безпеки

Хоча генна терапія для регенерації є багатообіцяючою, безпека є критично важливим аспектом. Ті ж самі шляхи росту, які допомагають аксонам, можуть також спричинити проблеми, якщо їх не контролювати. Як зазначалося, постійне видалення PTEN становить ризик раку (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Аналогічно, хронічна активація mTOR може призвести до росту пухлин (наприклад, у пацієнтів з TSC1/2 виникають пухлини). Генна терапія, що стимулює фактори росту (такі як сконструйовані RAS або інші онкогени), повинна ретельно контролюватися. Зокрема, в експериментальній AAV-RAS терапії пухлин в очах мишей не спостерігалося (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), але автори наголошують на використанні регульованих (індукованих) систем на випадок необхідності вимкнення будь-якої онкогенної активності (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Інші проблеми безпеки включають загибель клітин та імунні реакції. Деякі втручання шкодять певним клітинам: наприклад, надмірна експресія Sox11 знищила багато альфа-типів ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Будь-яка терапія, що вбиває ГКС, нівелює свою користь. Існує також ризик пошкодження від ін'єкцій або запалення. Індукування запалення (зимозан) сприяло регенерації у мишей, але у людей це було б небезпечно. Довгострокові ефекти вбудовування AAV (наприклад, інсерційний мутагенез) низькі, але будь-яка очна генна терапія потребує ретельної оцінки. Коротше кажучи, кожен ген, що стимулює ріст, повинен бути збалансований з потенційною шкодою: ідеально, якщо він доставляється тимчасово або під жорстким контролем.

Стратегії генної доставки

Доставка генів у потрібні клітини є ключовим викликом. Для ГКС аденоасоційовані віруси (AAV) є основними векторами. AAV — це безпечні, нереплікуючі віруси, які можуть доставляти терапевтичні гени в клітини сітківки. Поширеним методом є інтравітреальна ін'єкція: введення AAV безпосередньо у склоподібне тіло ока. AAV2 є класичним серотипом для трансдукції сітківки; він ефективно досягає ГКС при інтравітреальній ін'єкції (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Фактично, одне дослідження виявило, що інтравітреальний AAV2 трансдукував понад 90% ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Можна використовувати й інші капсиди. Наприклад, AAV6, введений інтравітреально, демонструє дуже високий тропізм до внутрішньої сітківки та шару ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Вчені також розробляють варіанти AAV2 (такі як мутації або химери), щоб ще краще долати бар'єри сітківки, але ці деталі розвиваються.

Інший шлях — супрахоріоїдальна ін'єкція, при якій голка або мікроканюля доставляє AAV між склерою та хоріоїдеєю (судинною оболонкою). Цей підхід широко розповсюджує вектор під сітківкою. Супрахоріоїдальний AAV8 у мавп призвів до широкої експресії генів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Це можна зробити за допомогою спеціально розроблених мікроголок. Супрахоріоїдальна доставка дозволяє уникнути великих операцій, але все ж є інвазивною і може викликати місцеве запалення. Фактично, супрахоріоїдальний AAV8 викликав легкий хоріоретиніт (запалення хоріоїдеї), що вимагав застосування стероїдів, хоча він зник через кілька тижнів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Важливо, що супрахоріоїдальна доставка викликала слабші системні антитілові відповіді до капсиду AAV, ніж інтравітреальна доставка (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Це, ймовірно, пояснюється тим, що частина вірусу по-різному виходить з ока. Загалом, супрахоріоїдальна ін'єкція є багатообіцяючою для генної терапії задньої частини ока, але її імунні ефекти потребують управління.

Імуногенність

Навіть попри те, що око є дещо «імунопривілейованим», доставка генів за допомогою AAV все ще може провокувати імунні реакції. Інтравітреальний AAV часто витікає з ока через дренажні канали. Одне дослідження на приматах виявило, що інтравітреальний AAV призвів до приблизно в 400–500 разів більшої кількості вірусу в крові порівняно з субретинальною ін'єкцією (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Це викликало дуже сильну антитілову відповідь проти капсиду AAV (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Навпаки, субретинальний AAV (введений під сітківку) секвеструється в оці і зазвичай викликає майже відсутність антикапсидних антитіл (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Супрахоріоїдальний AAV знаходиться посередині: частина вірусу залишається в оці, тоді як частина досягає прилеглих тканин. Дослідження показують, що супрахоріоїдальний AAV викликає м'якше вироблення антикапсидних антитіл, ніж при інтравітреальному введенні (pmc.ncbi.nlm.nih.gov), але він може стимулювати імунні клітини проти генного продукту (як це спостерігалося з GFP), оскільки він трансдукує клітини за межами гематоретинального бар'єру (pmc.ncbi.nlm.nih.gov).

Крім антитіл, Т-клітинні відповіді можуть атакувати трансдуковані клітини. Якщо вставлений ген продукує білок, який організм розцінює як чужорідний (як GFP в експериментах), імунні клітини можуть знищити ці клітини. Навіть справжні людські гени іноді можуть викликати низький рівень запалення. Клінічні випробування генної терапії сітківки (наприклад, для RPE65) часто передбачають застосування стероїдів для приглушення цієї відповіді. Шляхи, що залишаються в межах сітківки (субретинальний, супрахоріоїдальний), як правило, є менш імуногенними в цілому, ніж вітреальні ін'єкції (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Майбутні терапії повинні будуть збалансувати ефективну доставку з мінімальною імунною активацією, можливо, використовуючи новіші типи AAV або імуносупресивні режими.

Перехід до лікування глаукоми

Глаукома представляє інший виклик, ніж гостре пошкодження нерва. При глаукомі ГКС повільно відмирають через такі фактори, як високий внутрішньоочний тиск, знижений кровотік і стрес. Для лікування глаукоми генна терапія повинна працювати в умовах хронічного пошкодження. Це означає, що важливе значення має час: терапію, можливо, потрібно буде застосовувати рано для захисту ГКС, або періодично для переналаштування сигналів росту. На щастя, деякі роботи починають заповнювати цю прогалину. У недавньому дослідженні вчені використовували AAV для доставки постійно активного рецептора TrkB (F-iTrkB) в очі мишей з моделлю глаукоми. Ці миші показали як захист ГКС, так і значну регенерацію аксонів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Це свідчить про те, що навіть за глаукоматозних умов активація шляхів росту може допомогти.

Проте, перехід від моделей роздавлювання до людської глаукоми вимагатиме більше кроків. Нам потрібно тестувати ці генні терапії на тваринних моделях глаукоми (наприклад, індукованої очної гіпертензії або генетичних моделях), а не лише при роздавлюванні. Ми також повинні враховувати старіння та хворобливе середовище: старі нейрони, рубцева тканина та коливання внутрішньоочного тиску. Ймовірно, буде необхідно поєднувати генну терапію зі стандартним лікуванням глаукоми (зниження тиску, використання нейротрофічних факторів) та використовувати контрольовані генні системи. Наприклад, як зазначалося, конструкції AAV можуть використовувати індуковані промотори, щоб ген фактора росту можна було вимкнути після регенерації аксонів (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Оскільки глаукома у людини прогресує повільно, однієї генної ін'єкції може бути недостатньо; може знадобитися повторне дозування або довготривалі вектори. Отже, перехід цих результатів до терапії глаукоми означатиме коригування динаміки хронічного пошкодження та забезпечення безпечності й довговічності лікування.

Висновок

Генна терапія, що модулює внутрішні шляхи ГКС, демонструє захоплюючий потенціал: у гризунів вона може відновити ріст зорового нерва і навіть відновити деякий зір. Ключові стратегії, такі як активація PTEN/mTOR, делеція KLF4 або надмірна експресія Sox11, кожна забезпечує регенеративний імпульс через різні клітинні програми. Дослідження на мишах підтверджують, що аксони можуть реіннервувати мозок і покращувати прості зорові завдання (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Проте, необхідно вирішити проблеми безпеки (онкогенний ризик, втрата клітин, імунна відповідь) та вдосконалити методи доставки. Прогрес у векторах AAV та очних ін'єкціях надає інструменти для ефективного таргетування ГКС (pmc.ncbi.nlm.nih.gov) (pmc.ncbi.nlm.nih.gov). Наступні кроки включають тестування на моделях хронічної глаукоми, оптимізацію дозування та промоторів, а також поєднання генної терапії з лікуванням глаукоми. Загалом, доклінічні дані рішуче підтримують подальший розвиток: ретельне налаштування внутрішніх шляхів росту може фундаментально змінити перспективи відновлення зорового нерва.